陈 明 孙 哲 王思斯 王文萍 黄重铭 彭慧婷 林晓彤 曹 洋

1.广州中医药大学第一附属医院肿瘤中心，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405

根据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2020 年全球最新癌症负担数据，肺癌新发病例高达220 万例，死亡病例180 万例，死亡率居恶性肿瘤之首，是癌症死亡的主要原因[1]。非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌的85%，是肺癌中最常见的病理类型[2]。既往我国晚期NSCLC 的5 年生存率仅5%左右[3]。中药复方金福安汤是国医大师邓铁涛教授治疗肺癌的经验方，由生半夏、生南星、丹参、桃仁、壁虎、山慈菇、浙贝母、苇茎、薏苡仁、太子参组成，具有化痰祛瘀的功效[4]。既往研究显示，金福安汤联合化疗治疗中晚期NSCLC 具有稳定瘤体、缓解临床症状、改善生存质量、减少化疗不良反应等作用[4-6]。然而，由于中药复方的复杂性，目前对金福安汤的有效成分及其作用机制尚不十分清楚。该研究基于网络药理学与分子对接技术[7-8]，建立了“药物-靶点-通路-疾病”网络，以期筛选出金福安汤活性成分，探索金福安汤治疗NSCLC 的作用机制。

1 资料与方法

1.1 金福安汤化合物的筛选

金福安汤中每一味中药的有效成分的数据都通过两种方式收集：①文献，主要在美国国立医学图书馆（National Library of Medicine，PubMed）和中国知网（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）中检索，检索时间为1980 年1 月至2021 年1 月；②中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）[9]，结合两个重要的药动学参数，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18[10-11]。

1.2 金福安汤靶点的预测

从PubChem 数据库中收集化合物的典范简化分子线形结构（canonical SMILE）或2D、3D 结构，导入SwissTargetPrediction 数据库，选择物种“智人”进行靶点预测。

1.3 NSCLC 疾病靶点的获取

使用关键词“non-smallcelllungcancer”在GeneCards数据库和OMIM 数据库中搜索，将搜索到的靶点汇总再删除重复数据后得到NSCLC 疾病靶点。

1.4 NSCLC 与金福安汤的共同靶点

将NSCLC 与金福安汤的靶点上传至Venny 2.1.0网站，得到靶点的交集，并用Venn 图表示。选择这些共同靶点作为金福安汤治疗NSCLC 的潜在作用靶点。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）分析

将共同靶点上传至STRING 数据库，选择物种“智人”，置信度0.7，得到蛋白质互作网络。STRING 数据库自定义的置信度区间为：低为[0.15，0.4）；中为[0.4，0.7）；高为[0.7，0.9）；最高为[0.9，1]。

1.6 共同靶点通路分析

通过David 数据库中的KEGG 对共同靶点进行通路富集分析。借助omicshare 网站绘制KEGG 通路高级气泡图。

1.7 可视化网络的构建

使用Cytoscape 软件进行可视化网络的构建：①“中药-化合物-共同靶点”网络；②“中药-化合物-核心靶点-核心通路”网络。核心靶点、核心化合物、核心通路通过拓扑分析筛选，拓扑分析主要应用Network-Analyzer 模块计算，只有度值、中介中心性和接近中心性＞相应平均值的节点才被纳入[12]。

1.8 核心靶点的分子对接

运用PyRx-Virtual Screen Tool 软件将核心靶点与金福安汤核心化合物进行分子对接。该分子对接的评价标准为：-7 kcal/mol≤对接结合能＜-5 kcal/mol，表明靶点与化合物具有一定的结合亲和力；-9 kcal/mol≤对接结合能＜-7 kcal/mol，结合亲和力良好；对接结合能＜-9 kcal/mol，结合亲和力较强[13]。

2 结果

2.1 金福安汤活性化合物

通过TCMSP 数据库筛选得到135 个化合物，文献检索得到24 个化合物。2 个化合物在PubChem 上搜索不到，21 个化合物在PubChem 中搜索不到canonical SMILE，12 个化合物预测不到靶点，再排除16 个重复项，最终纳入108 个化合物。

2.2 金福安汤与NSCLC 的共同靶点

金福安汤一共预测到6783 个靶点，剔除可能性＜0.2 的靶点，再删除重复项后，最终纳入178 个。NSCLC相关靶点，在GeneCards 数据库中收集到4180 个，在OMIM 数据库中收集到483 个，合并后去除重复项，最终得到4549 个。金福安汤和NSCLC 共同靶点有124 个。Venn 图见图1，图中的百分率代表相应区域的靶点数量占金福安汤和NSCLC 靶点并集的比例。

图1 金福安汤与非小细胞肺癌的共同靶点Venn 图

2.3 共同靶点PPI 网络

使用STRING 数据库分析了124 个共同靶点的相互作用，将结果导入Cytoscape 软件进行拓扑分析。最终一共得到19 个关键靶点，选择其中排序前6 位的 靶 点STAT3、SRC、PIK3R1、EGFR、AKT1 和AR 作为金福安汤治疗NSCLC 核心靶点。共同靶点PPI 网络见图2。

图2 金福安汤与非小细胞肺癌的共同靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络

2.4 “中药-化合物-共同靶点”网络

使用Cytoscape 构建“中药-化合物-共同靶点”，见图3。进行拓扑分析，最终一共得到16 个核心化合物，具体信息见表1。

表1 金福安汤治疗非小细胞肺癌的核心化合物具体信息

图3 “中药-化合物-共同靶点”网络图

2.5 KEGG 通路富集分析

通过DAVID 数据库对共同靶点进行KEGG 通路富集分析，根据P 值（Benjamin 方法校正，P ＜0.05 视为显著富集），得到金福安汤治疗NSCLC 的相关通路41 条。将P 值进行排序，最终通过气泡图呈现20 条与NSCLC 密切相关的通路，见图4。再进一步构建“中药-化合物-核心靶点-核心通路”网络，筛选出与核心靶点密切相关的核心通路15 条。见图5。

图4 前20 条KEGG 通路富集分析气泡图（P ＜0.05）

图5 “中药-化合物-核心靶点-核心通路”网络图

2.6 分子对接

将核心化合物及其预测的核心靶点进行分子对接，见表2（部分）。结果表明，表中所有对接结合能都＜-5 kcal/mol，且绝大部分＜-7 kcal/mol，提示均有良好的结合能力。因文章篇幅限制，仅展示部分示意图，见图6。

图6 核心化合物及其预测的核心靶点的分子对接示意图（部分）

表2 核心化合物及其预测的核心靶点的分子对接结果（部分）

3 讨论

中医学认为肺癌是一种全身属虚、局部属实的疾病，其核心病机可概括为“虚”“痰”“瘀”“毒”。金福安汤主要针对“痰、瘀”立方，方中生半夏、生南星化痰散结及丹参、桃仁活血祛瘀，并为君药，壁虎、山慈菇解毒散结，消肿定痛，为臣药，浙贝母、苇茎清热化痰，薏苡仁、太子参健脾益气，为佐助药，全方共奏化痰祛瘀、消癥散结之功。金福安汤的前期基础研究围绕着p120 连环蛋白（p120 catenin，p120ctn）展开，机制主要集中在上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）上[14]。然而，金福安汤的有效成分目前尚未明确，作用机制仍有待进一步探索。

“中药-化合物-核心靶点-核心通路”网络图主要围绕核心靶点来构建，图中包含非核心化合物。筛选出的核心通路大致可分为4 类：第1 类是细胞增殖和凋亡途径，如自噬、癌症中的microRNAs、PI3K-Akt、FoxO 信号通路等；第2 类是血管生成途径，即VEGF信号通路；第3 类是细胞黏附途径，包括癌症中的蛋白聚糖、黏着连接、焦点粘连等通路；第4 类是免疫调节途径，包括TNF 和B 细胞受体信号通路。其调节着细胞生长、增殖分化、侵袭转移等多种功能，调控NSCLC 的发生发展。

通过TCMSP 数据库筛选和文献检索[15-20]最终得到金福安汤活性化合物108 个，化合物靶点178 个，NSCLC 疾病靶点4549 个，两者共同靶点124 个，其中核心靶点6 个：STAT3、SRC、PIK3R1、EGFR、AKT1和AR。PI3K-Akt 信号通路是EGFR、SRC 的下游共同信号通路，核心靶点EGFR、SRC、PIK3R1、AKT1 均处于这一信号通路上。目前，从lumican/p120ctn 复合体调节PI3K-Akt 信号通路的角度探讨金福安汤干预肺癌转移机制的相关实验正在进行中。另外值得一提的是，p120ctn 是SRC 磷酸化的底物，SRC 可通过整合素/黏着斑激酶途径介导正常细胞的黏附和迁移[21]。

而在筛选出的核心活性成分中，木犀草素与AKT1、SRC、EGFR、PIK3R1 皆有良好的结合能力。木犀草素可抑制NSCLC A549 细胞增殖、侵袭及迁移能力，诱导细胞凋亡[22]；通过调节肌钙蛋白表达、收缩细胞骨架等机制逆转EMT[23]。黄芩素能通过靶向Src/Id1 途径抑制肺癌细胞生长[24]；还能增强顺铂毒性，增强化疗敏感性，其机制可能是阻断细胞内Akt/NF-κB 信号通路，从而抑制EMT 的发生[25]。

本研究存在一些不足之处。第一，不可避免误筛一些活性化合物，譬如与STAT3 均有良好结合的隐丹参酮、小红参醌乙、丹参醛；第二，金福安汤具体活性成分需进一步通过分离提取、质谱仪分析等手段来确定，具体作用机制亦需通过实验来进一步验证。

综上所述，本研究通过网络药理学及分子对接技术，初步揭示了金福安汤治疗NSCLC 的核心化合物与作用机制，呈现了金福安汤在治疗NSCLC 中的多个成分、靶点、通路之间的复杂网络关系，为后续深入研究金福安汤治疗NSCLC 的作用机制提供了一定参考。