高效液相色谱法测定穿梅三黄散中黄芩苷的含量

2021-11-27方忠意刘素梅刘占通邱天宝王军红

河南畜牧兽医 2021年19期

方忠意，刘素梅，刘占通，邱天宝，韩立，王军红

（河南省兽药饲料监察所，河南郑州 450008）

穿梅三黄散收载于《中国兽药典》2020年版二部中，是由大黄、黄芩、黄柏、穿心莲、乌梅五味药材经粉碎、过筛和混匀制备而成的中兽药散剂，主要用于治疗水产动物细菌性败血症、肠炎、烂鳃与赤皮病［1-2］。黄芩苷属黄酮类化合物，对多种病毒、真菌、细菌具有抑制作用［3-5］，常用其含量作为评价黄芩及其制剂质量的一种手段。目前，《中国兽药典》中穿梅三黄散的质量标准只有显微和薄层鉴别检验，缺少含量测定的方法和指标。该研究参考了部分文献［6-7］，建立了黄芩苷含量测定的高效液相色谱法，可以更加精准地评价穿梅三黄散质量，为兽药生产企业加强产品质量控制提供了参考手段。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器设备

Waters高效液相色谱系统：包含2695分析系统、2487紫外检测器、Empower2色谱工作站；MILIPORE超纯水处理器；METTLERXP205电子天平。

1.1.2 试药试剂

黄芩苷对照品来自中国兽医药品监察所，批号为Z01271705，含量以96.8%计；穿梅三黄散样品为实验室自制（大黄25g、黄芩15g、黄柏5g、穿心莲2.5g、乌梅2.5g，粉碎，过筛，混匀即得）；穿梅三黄散阴性对照样品为实验室自制（大黄25g、黄柏15g、穿心莲2.5g、乌梅2.5g，粉碎，过筛，混匀即得）；乙腈、甲醇为色谱纯试剂，试验中使用的水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法与结果

1.2.1 色谱条件的选择

参考相关有关文献，通过比较不同色谱洗脱条件，以样品中黄芩苷色谱峰的峰形是否对称、有无杂质干扰为原则，确定色谱条件为：XBridgeC18（5μm，4.6mm×150mm）色谱柱，柱温为30℃，流动相为乙腈-0.2%磷酸（22∶78），检测波长为278nm，进样量为10μl。

1.2.2 样品溶液的制备

1.2.2.1 供试品溶液的制备精密称取样品0.15g，置100ml容量瓶中，加70%乙醇至近刻度，超声处理30min，放至室温，加70%乙醇稀释至刻度，混匀，过0.45μm微孔滤膜即得。

1.2.2.2 阴性对照样品溶液的制备精密称取阴性对照样品0.11g，置100ml容量瓶中，加70%乙醇至近刻度，超声处理30min，放至室温，加70%乙醇稀释至刻度，混匀，过0.45μm微孔滤膜即得。

1.2.2.3 提取方法的考察精密称取穿梅三黄散供试品0.15g，共8份，置于100ml量瓶中，加70%甲醇溶液至刻度，分别超声10、20、30、40min，每种超声时间做2份平行，提取液分别进样。通过比较穿梅三黄散供试品中黄芩苷的含量，考察不同时间提取效果。结果表明，不同超声时间提取效果差别不大，但还是以超声提取30min提取效果最好。

1.2.3 线性关系考察

精密称定黄芩苷对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为黄芩苷对照品贮备液；分别精密量取黄芩苷对照品贮备液适量，加70%乙醇，配制成浓度为2、4、10、20、50、100μg/ml的系列对照品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤后进高效液相色谱仪。记录色谱图，以对照品溶液浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数，结果见图1。

图1 黄芩苷标准曲线图

1.2.4 准确度试验

精密称取6份穿梅三黄散阴性对照样品0.11g，分别精密加入6mg黄芩苷对照品，按1.2.2.1项下供试品溶液制备方法进行处理，按1.2.1项下色谱条件进行进样，按外标法以峰面积计算黄芩苷含量及RSD，结果见表1。

表1 准确度试验结果

由表1可见，该方法准确性好，可以很好地对黄芩苷进行定量测定。

1.2.5 精密度试验

取同一批样品，共6份，按照1.2.2.1项下供试品溶液制备方法进行处理，按照1.2.1项下色谱条件进行进样，按外标法以峰面积计算黄芩苷含量及RSD，结果见表2。

表2 精密度试验结果

1.2.6 耐用性试验

采用XBridgeC18（5μm，4.6mm×150mm）色谱柱，柱温为30℃，取同一份供试品溶液，分别用乙腈-0.2%磷酸（76∶24）、乙腈-0.2%磷酸（78∶22）、乙腈-0.2%磷酸（80∶20）为流动相进行采样，得到不同比例条件下的色谱图。在3个不同比例的流动相条件下，黄芩苷的色谱峰均能与杂质峰完全分离，满足不同的需求。

1.2.7 专属性试验

取阴性对照样品0.11g，按1.2.2.2项下供试品溶液制备方法进行处理，之后按照1.2.1项下色谱条件进行进样，记录色谱图，结果见图2至图5。