厌氧氨氧化工艺处理不同抗生素废水的性能比较

2021-11-26张肖静马冰冰张涵位登辉张红丽胡浩赵子睿

化工学报 2021年11期

张肖静，马冰冰，张涵，位登辉，张红丽，胡浩，赵子睿

（郑州轻工业大学材料与化学工程学院，河南郑州450001）

引言

厌氧氨氧化是一种新型脱氮工艺，与亚硝化工艺结合可以在不消耗有机碳源的条件下实现自养脱氮，相比传统的硝化-反硝化工艺能够节省63%的曝气能耗，而节省下来的有机物可以转化为能源性气体甲烷，符合可持续污水处理的要求[1-3]。厌氧氨氧化工艺的功能微生物是厌氧氨氧化菌（anaerobic ammonium-oxidizing bacteria, AAOB），该类细菌生长缓慢、难以富集，且对环境条件非常敏感，限制了该工艺的发展及应用[4]。

我国是抗生素生产和使用大国，各级医院住院患者抗生素使用率超过70%，远高于世界卫生组织所推荐的使用率（30%），尤其是磺胺类和四环素类的抗生素，近年来其使用量大幅度增加。抗生素的大量使用导致其不可避免地进入人类生活的环境，据报道，目前已经在淡水、土壤、污水厂等环境中检测到了抗生素的存在[5-9]。在这两类抗生素中，以磺胺甲唑（SMX）和土霉素（OTC）为代表，其使用最为广泛，在多种环境中被频繁检出。例如，在城市污水厂中检测到了3 μg/L 的SMX[10]，在家禽养殖废水中检测到了0～2.3 mg/L 的SMX[11]，而在城市污水厂二沉池出水中SMX 浓度则为115～534 ng/L[12]。同样，OTC 也在类似环境中被检测到，浓度从0.07 ng/L～19.55 mg/L 不等[13-16]。更为重要的是，已有多项研究表明，抗生素对多种污水处理工艺表现出明显抑制作用，包括硝化反硝化工艺、厌氧氨氧化自养脱氮工艺等[17-19]。例如，Wang 等[20]的研究表明，抗生素的加入降低了微生物群落的多样性和反硝化菌属的丰度。Zhang 等[21]研究发现，当OTC 浓度为40 mg/L 时，厌氧氨氧化菌的相对丰度从16.40%下降到9.35%。当OTC 浓度大于40 mg/L 时，部分微生物死亡，厌氧氨氧化菌的相对丰度下降到4.6%。厌氧氨氧化作为一种最具发展前景的脱氮工艺，同时也是可持续污水处理系统的重要组成单元，明确抗生素对其影响机制对于该工艺的发展应用至关重要[22]。

因此，本文针对应用较为广泛的SMX 和OTC 两种抗生素，分别考察了其在不同浓度、不同暴露时间下对厌氧氨氧化生物膜活性、胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）分泌及功能微生物演替的影响规律，考虑到SMX 和OTC 在多种环境中的浓度范围[15,23]，选择1～1000 μg/L 的抗生素为本文的研究对象，并重点对两种抗生素的不同作用进行了对比，以期为厌氧氨氧化处理含抗生素废水或者应用于有抗生素暴露风险的污水处理领域提供一些理论指导。

1 实验材料与方法

1.1 实验设计

采用两个相同的厌氧氨氧化滤柱，标为1#和2#。滤柱有效体积为2 L，由底部进水，顶部出水，连续运行。滤柱内部以火山岩为填料，火山岩粒径为6～8 mm，采用人工配水，配水包括50 mg/L 的氨氮，50 mg/L 的亚氮，1000 mg/L的碱度，分别以（NH4）2SO4、NaNO2、NaHCO3配制，同时加以CaCl2、KH2PO4、MgSO4，以及1 ml/L 的微量元素，进水pH 为7.8 左右，HRT 为4 h。将两个厌氧氨氧化滤柱中的生物膜分别在不同浓度（1、10、100、1000 μg/L）的抗生素中短期暴露（6 h）和长期暴露（22 d）后，测定其微生物活性、EPS和微生物组成。

1.2 活性测定序批实验

首先，在没有接触抗生素时测定两个生物滤柱中生物膜的活性，作为空白对照。之后依次在不同浓度的抗生素中分别暴露6 h 和22 d 后，再分别测定活性。具体方法为：从火山岩填料上取下约10 mg生物膜，置于10 ml离心管中，采用实验用水清洗三次之后，再次加入实验用水至10 ml，放置于恒温振荡床上。反应温度为25 ℃，pH 为8.0，反应时间为6 h，将反应始末的水样取出测定氨氮、亚氮和硝氮，根据式（1）计算厌氧氨氧化活性（SAA）。三个离心管同时测定，取平均值。

1.3 EPS和溶解性微生物产物的测定

EPS 提取过程如下[24]：首先取5 ml 生物膜样品于8000 r/min 离心15 min，取上清液保存待测溶解性微生物产物(SMP)；离心沉淀在磷酸缓冲溶液中再悬浮，40 kHz 超声处理3 min；混合物在80 ℃水浴中加热30 min，每10 min 摇匀一次；悬浮液8000 r/min离心15 min，收集上清液进行EPS测定，剩余物质测定污泥质量。用Folin-phenol 法在500 nm 波长处测定提取液中的蛋白质（PRO），用蒽酮法在625 nm 波长处测定提取液中的多糖（PS）。

1.4 分析方法

氨氮采用纳氏试剂分光光度法在410 nm 波长处测定，亚氮采用N-1-萘基乙二胺分光光度法在波长540 nm 处测定，硝氮采用紫外分光光度法在220和275 nm 波长处测定，pH、DO 和温度采用WTW 多参数测定仪测定。

1.5 高通量测序

长期暴露在不同浓度的抗生素中后，取生物膜样品进行高通量测序分析。采用通用引物338F/806R 对16S rRNA 基因V3-V4 区进行PCR 扩增，利用Illumin公司的Miseq PE300 平台进行测序。根据97%的相似度对序列进行OTU 聚类分析。将每条序列与Silva数据库（SSU132）进行比对，得到物种分类。分析计算Shannon、Simpson、ACE、Chao1等多样性指数。

2 结果与讨论

2.1 抗生素短期和长期暴露对厌氧氨氧化活性的影响

厌氧氨氧化生物膜分别在不同浓度的两种抗生素中暴露6 h 和22 d 之后的SAA 如图1 所示。1#生物膜未暴露在OTC 抗生素中时，其SAA 为14.6 mg/(h·g SS)，而在1 μg/L 的OTC 中暴露6 h 后，再次测定其SAA 为14.5 mg/(h·g SS)，该结果与未暴露在OTC 中的SAA 相比变化不大，说明1 μg/L 的OTC 对厌氧氨氧化生物膜的短期影响不大。在10、100、1000 μg/L的OTC中短期暴露后，SAA随着OTC浓度的增加，逐渐降低为12.2、12.0 和11.6 mg/(h·g SS)。这个结果说明10 μg/L 的OTC 短期作用对厌氧氨氧化生物膜造成了严重的抑制（p＜0.05），而在此基础上继续增加抗生素浓度，虽然依然有抑制，但抑制程度没有进一步加强。由此可知，OTC 对厌氧氨氧化短期抑制的阈值为10 μg/L。

图1 在不同抗生素中暴露不同时间后的厌氧氨氧化活性Fig.1 Anammox activity after exposure to different antibiotics for different time

1#厌氧氨氧化滤柱的生物膜长期暴露在1 μg/L的OTC 中22 d 之后，测定其SAA 为14.5 mg/(h·g SS)，这与短期暴露后的SAA 相同，说明1 μg/L 的OTC 对厌氧氨氧化生物膜的短期作用和长期作用规律是一致的，均对微生物活性影响不大。而长期暴露在10 μg/L 的OTC 之后，同样对厌氧氨氧化生物膜表现出了抑制，SAA 降低为13.3 mg/(h·g SS)。值得注意的是，该值高于短期作用后的SAA，推测是在长期暴露过程中，厌氧氨氧化生物膜对OTC 逐渐有了适应性，因而生物活性表现出一定的耐受能力。而进一步在100 μg/L 的OTC 中长期暴露后，SAA 不仅没有降低，反而升高到了15.1 mg/(h·g SS)。这与短期暴露的结果是不同的，该结果进一步证明了厌氧氨氧化生物膜长期暴露在OTC 中后表现出了适应性，这也可通过2.4 节的微生物丰度的增加进一步证明。有研究表明，微生物在长期接触抗生素后可促进抗性基因的富集，通过诱导抗性基因进而对其表现出适应性[25-26]。然而，在OTC 增加到1000 μg/L 之后，长期暴露后的SAA 显著下降，降低到11.1 mg/(h·g SS)（p＜0.05）。这说明此时达到了OTC的抑制阈值，长期抑制阈值为1000 μg/L。

2#厌氧氨氧化滤柱的生物膜在SMX 中短期暴露之前，SAA 为14.5 mg/(h·g SS)，而在1 μg/L 中短期暴露后，SAA 轻微降低为14.3 mg/(h·g SS)，之后在10、100、1000 μg/L 中短期暴露后，SAA 分别降低为13.8、13.7 和13.1 mg/(h·g SS)。在浓度1～1000 μg/L范围内，虽然随着SMX 的增加，SAA 呈现出逐渐降低的趋势，但整体降低不够显著，这说明厌氧氨氧化生物膜对SMX的抵抗性较强。长期暴露在1、10、100、1000 μg/L 的SMX 中后，SAA 分别变化为14.8、14.3、14.1 和13.6 mg/(h·g SS)。1 μg/L 的SMX 导致SAA 轻微增加，由于短期并未产生明显抑制，因此可能并不存在先抑制后适应的过程。有文献报道，低浓度的有机物有助于厌氧氨氧化的高效稳定运行[27]。此外，也有研究表明，低浓度的抗生素不会影响脱氮性能和微生物的活性[28]。因此，这一方面有可能是厌氧氨氧化生物膜对SMX 有较好的抗性，另一方面可能是SMX 诱导了反硝化来提高脱氮性能，该结果同样可通过微生物结果来证明。在随后增加SMX 浓度后，厌氧氨氧化生物膜活性在长期暴露后均表现出轻微的降低，不同浓度下其SAA 的降低程度与短期暴露后相差不大。这个结果说明无论是短期作用还是长期作用，1～1000 μg/L 的SMX 对厌氧氨氧化均表现出较小的影响，未带来明显的抑制。

2.2 抗生素对胞外聚合物的影响

EPS 是微生物自身分泌并释放到胞外的聚合物，在抵抗毒性抑制、承受环境压力等方面起着重要作用。EPS 的主要成分与微生物细胞非常相似，主要包括PRO和PS两大类，其主要作用是帮助细胞吸收营养，同时抵御杀菌剂和有毒物质对细胞的危害。

从图2 可知，1#反应器的生物膜在1 μg/L 的OTC 中长期暴露后，微生物响应较慢，分泌较少的EPS，且蛋白质和多糖均显著下降，这说明微生物在该环境下能够正常生长，处于稳定生长阶段。而在OTC 增加到10 μg/L 以后，EPS 大量增加，尤其是蛋白质的变化，从32.6 mg/gSS增加到85.49 mg/gSS，这是微生物受到毒性抑制的表现[29]。当微生物接触抗生素后，往往会分泌更多的EPS[30-31]。之后随着OTC浓度的增加，EPS的量再次显著增加，说明微生物通过分泌大量的EPS 而逐渐适应OTC，其活性逐渐得到恢复。在浓度增加至1000 μg/L时，微生物受到严重抑制，大量微生物死亡，其分泌的EPS 也逐渐减少。但值得注意的是，随着OTC 浓度的增加，SMP的含量逐渐上升，说明有一部分死亡的微生物产物溶解在生物膜中，这部分SMP 被微生物利用进行反硝化，反倒提高了微生物的活性。另外，PRO/PS 的值也逐渐下降，说明分泌的PS 逐渐增多，这也是微生物应对毒性的表现。

图2 在不同抗生素中长期暴露后的EPS和SMP结果Fig.2 EPS and SMP results after long-term exposure to different antibiotics

在2#反应器中，微生物快速响应，EPS 在1 μg/L的SMX中即轻微增加，之后则随着SMX浓度的增高而显著增加，这说明厌氧氨氧化生物膜对SMX 的响应较快，低浓度的SMX 即可刺激EPS 分泌量增加，从而保护厌氧氨氧化微生物免受有毒物质的抑制。因而在长期作用过程中，SMX 对SAA 的影响不大。但值得注意的是，SMP 中PRO/PS 的值一直降低，这可能是厌氧氨氧化菌应对SMX 的一种策略，通过分泌更多的溶解性多糖，来保护细胞免受伤害，该结果与OTC 的结果一致。Wang 等[32]将两个反应器中SMX浓度均控制为1 mg/L，在有EPS保护的情况下，微生物的OUR 值在145 h 后降为95 mg/(L·h)；而在没有EPS 保护的情况下，微生物的OUR 值则降至10 mg/(L·h)以下。由此可知，微生物接触SMX 后能够快速分泌较多的EPS以抵抗毒性抑制。

2.3 优势OTU和微生物多样性变化

将暴露在不同浓度抗生素的生物膜测序后，得到的多样性指数如表1所示。1#滤柱中，Shannon指数随着OTC 浓度的增高逐渐增大，说明OTC 的引入带来了新的微生物种群，使得微生物多样性增加，也间接说明了此时AAOB 受到其他微生物的影响。然而值得注意的是，在OTC 为100 μg/L 时，Shannon指数大幅度下降，而此时SAA增加，说明此时AAOB逐渐适应了OTC 的存在，活性恢复，而其他微生物则由于AAOB 的恢复而降低了活性及增殖，因而表现为多样性降低。然而在OTC 增加到1000 μg/L 之后，Shannon 指数再次增加，此时AAOB 再次受到抑制，活性与丰度均下降，其他微生物得以生长，反应器的性能与生物多样性呈现负相关。2#滤柱中，随着SMX 浓度的增加，Shannon 指数逐渐上升后趋于稳定，这说明生物膜内微生物多样性上升，同时ACE 指数逐渐增加，说明优势微生物的丰度在上升。这是因为SMX 已经成功诱导了反硝化菌，并与厌氧氨氧化耦合，因而整个过程系统比较稳定。Simpson 指数与Shannon 指数的变化趋势刚好相反，反映的规律一致。

表1 不同生物膜样品的多样性指数和主要功能微生物的相对丰度Table 1 The diversity index of different biofilm samples and the relative abundance of main functional microorganisms

ACE和Chao1指数分别用来反映优势OTU的丰富度和个数，其变化规律基本一致，同样反映出厌氧氨氧化滤柱在暴露于抗生素后物种种类和丰富度的增加。优势OTU（相对比例＞1%）共分布在七个不同的门，分别是：Planctomycetes、Proteobacteria、Gemmatimonadetes、Petiscibacteria、Acidobacteria、Armatimonadetes 和Deinococcus-Thermus，其生物学分类及相对丰度见表2和图3。在这七个门中，相对丰度最高的是Planctomycetes 门，只包含一个OTU，但相对比例达到了17.98%，说明其在厌氧氨氧化生物膜内占据优势地位。厌氧氨氧化菌属于Planctomycetes 门，这也证明了即使在长期暴露于抗生素的环境下，反应器依然是以厌氧氨氧化为主的反应系统，完成了大部分的脱氮过程。而Proteobacteria 门含有6 个OTU 种类，其中5 个属于Beta-Proteobacteria，包括了 Nitrosomonas、Denitritisomas、Acidovorax 等主要的种群。另外几个门均只包含一个OTU，相对比例较低，再次证明Planctomycetes 和Proteobacteria 在厌氧氨氧化系统的优势地位，这和之前的研究结果是一致的[33-34]，Beta-proteobacteria 是处理抗生素废水反应器中的主要优势微生物[35]。值得注意的是，在1#生物膜中，除了OTU1 之外，其他OTU 均是在未添加OTC 时最高，之后随着暴露在OTC 中，其丰度明显下降。OTU1对应的种属为Candidatus，属于AAOB菌，这个结果证明在加入OTC 后，厌氧氨氧化系统发生了明显的改变，生物多样性增加，原有的优势微生物受到抑制，比例下降。而2#生物膜则相反，优势OTU的相对丰度在此后的几个阶段均有所增加，说明其多样性改变不大，优势微生物没有发生改变。这个结果再次说明了OTC 和SMX 对厌氧氨氧化生物膜作用的不同。

图3 OTU分类结果Fig.3 OTU classification results

表2 优势OTU（＞1%）的生物学分类及相对丰度Table 2 The taxonomic results and relative abundances of the dominated OTU（＞1%）

2.4 脱氮功能微生物的丰度变化

经过与Silva 数据库比对，得到不同水平的生物分类。在门分类水平上，Proteobacteria 在两个滤柱不同阶段的所有生物膜中相对丰度均为最大，在1#滤柱的不同阶段分别为57.8%、28.5%、41.3%、31.6%、41.1%、在2#滤柱的不同阶段分别为31.5%、52.3%、55.9%、51.4%、51.1%。虽然1#生物膜在刚接触OTC 时，Proteobacteria 丰度急剧减少了29.3%，但随后能够逐渐恢复，并始终保持优势地位。而2#生物膜接触SMX 后，Proteobacteria 的丰度不仅没有下降，反而显著增加，并在不同浓度下保持稳定，这也间接反映了2#生物膜在接触SMX 后的稳定性。相对丰度较高的门其次为Planctomycetes，在不同阶段分别为19.0%、25.7%、12.3%、41.5%、20.7% 和15.0%、23.5%、17.2%、16.4%、12.6%。多篇文献报道，这两个门的微生物广泛存在于自养脱氮系统[33-34]。生物膜接触SMX 后，Proteobacteria 的增多有可能使其获得抗生素耐药性。关于抗生素的抵抗机理主要包括诱导可以编码抗生素改性或者失活的酶，诱导细菌细胞中抗生素靶点的突变，以及位于细菌细胞膜上的泵排出机制等[36-37]。考虑到厌氧氨氧化对OTC 的自我适应，其对于OTC 的抵抗作用有可能是由于泵出机制，而对SMX 则可能是由于降解作用。

属水平的微生物分类结果表明，长期暴露在不同浓度不同种类的抗生素中后，厌氧氨氧化生物膜的微生物组成发生了较大的属转移。厌氧氨氧化的功能微生物为AAOB，结合图4 和表1 可知，属于AAOB 功能菌的CandidatusKuenenia是1#生物膜中的优势微生物，其相对丰度在不同OTC 浓度下表现出较大的波动，最初接触OTC 时对AAOB 有刺激强化作用，AAOB 的相对丰度从16.4%增加到23.4%，在OTC 浓度增加为10 μg/L 之后又受到抑制，并在100 μg/L OTC时增强，而在1000 μg/L OTC时再次受到抑制，这与微生物活性的测定结果表现出良好的正相关。而在不同浓度的SMX 中暴露的生物膜相对丰度分别为13.85%、20.19%、14.31%、14.15%和9.43%，表现出先增大再减小的趋势。这说明AAOB对抗生素的响应均为：先刺激增强再被抑制。值得注意的是，在接触抗生素后，两个反应器中均诱导出反硝化菌Denitritisoma，且表现出不同的变化趋势。1#滤柱中，OTC 对反硝化菌的诱导较慢，仅在OTC达到1000 μg/L时表现出明显的增殖，相对丰度从0.14%增加到4.2%，而此时AAOB已经受到抑制，反硝化菌Denitritisoma的增加有可能是在长期抑制下微生物死亡残体的分解提供了有机质，促进了反硝化反应的发生。不同的是，在2#滤柱中，生物膜一接触SMX 就立即诱导出反硝化菌，Denitritisoma的相对丰度从0.01%分别增加到3.29%、14.94%、10.43%和13.89%，相对比例较高。反硝化菌可以充分降解SMX 并利用死亡微生物的残体，因此减轻了SMX 对厌氧氨氧化生物膜的毒性，因而2#滤柱始终处于抑制程度较轻的状态。

图4 属水平的微生物分类结果Fig.4 Microbial classification results at the genus level

2.5 SMX和OTC影响微生物活性的机理

通过比较1#和2#生物膜在不同抗生素中分别暴露相同时间后的活性、微生物特征、污泥性能可得知，在短期和长期作用中SMX 对厌氧氨氧化生物膜的影响较小。结合EPS 的结果来看，生物膜在接触低浓度的SMX 后，微生物快速响应，分泌出大量的EPS，EPS 可以快速吸附抗生素，阻止其进入细胞内部，因而也减轻了其毒性。在后续不同浓度下，EPS 含量逐渐增多，直到SMX 浓度达到1000 μg/L时，微生物受到抑制，分泌的EPS 不足以抵抗SMX的毒性，因而生物膜活性降低，AAOB 丰度下降。有研究报道，微生物可以通过生长代谢或共代谢的方式对SMX进行转化或部分降解，或者把SMX作为碳源和能源，将其彻底降解或者转化。Wen 等[38]采用A/O-MBR 工艺处理含SMX 的污水，处理系统中SMX 浓度为3 mg/L 时，生物降解作用去除了90.07%的SMX，系统氨氮去除率能够稳定在90%以上。另有研究表明，绝大多数SMX 降解菌都属于Proteobacteria 菌门[39]，尤其是革兰阴性菌对SMX 具有较强的降解能力[40]。而本文测序结果表明，Proteobacteria 菌门占比相对较高，多种反硝化菌均属于该菌门，同时厌氧氨氧化系统中主要微生物均为革兰阴性菌，由此推断该系统对SMX 有一定的降解作用。而结合微生物种群的变化可知，厌氧氨氧化生物膜在接触SMX 后，快速诱导出反硝化菌，且反硝化菌的比例快速增长，并以SMX 为碳源进行反硝化，同时实现了SMX 的降解和进一步脱氮。总之，暴露在SMX 中的生物膜，通过快速的EPS 响应及相应的属水平转移，能够适应1000 μg/L 以下的SMX。

而暴露在OTC 中的生物膜则表现出不同的性能。厌氧氨氧化生物膜在最初接触OTC 后，并未受到明显的影响，这也间接导致微生物没有快速启动响应机制，相对丰度反而在受到刺激后表现出明显的增强，从16.4%增加到23.4%。然而，在OTC 的浓度增加到10 μg/L之后，微生物在短期暴露中受到强烈的抑制，活性明显下降，虽然在长期暴露中有所适应，抑制程度减轻，但依然导致了厌氧氨氧化菌的相对丰度降低为10.7%，而此时虽然EPS 大量增加，但并不足以抵抗其抑制。同时此类抗生素能够特异性地与细菌核糖体30S 亚基的A 位置结合，阻止氨基酰-tRNA 在该位置上的联结，从而抑制肽链的增长和蛋白质合成[23,41]，因而导致了较深的抑制程度。研究表明，长期接触四环素会抑制氨单加氧酶的合成，使氨氧化过程受到抑制[42]，这有可能是OTC抑制厌氧氨氧化过程的主要原因。此外，反硝化菌在整个过程中没有得到足够的诱导，仅在OTC 浓度为1000 μg/L时其相对丰度有明显的增加，这可能是由于反硝化菌不能快速降解OTC，同时该生物膜内并没有大量产生SMP 供反硝化菌所利用的原因。因此，同样浓度的OTC 对厌氧氨氧化表现出显著抑制。