孙嫘 韩敏娟 李娜 刘娟 乔海法

肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种神经退行性疾病，以上、下运动神经元选择性损害为特征，平均生存率为3.5年[1]。调查显示，中国ALS患病率约为3.1/10万人[2]。目前，仅利鲁唑对ALS有暂时缓解作用[3]。ALS患者相关基因突变或通路异常表达，动态平衡破坏而导致体内氧自由基累积，引起氧化应激反应，导致ALS运动神经元的进行性损伤及丢失。肌萎缩侧索硬化SOD1 G93A转基因小鼠(SOD1 G93A transgenic mice，SOD1G93A)与人类ALS 发病特点极为相似，该鼠从胚胎发育后期已出现神经退行性变[4]，同时客观反映了氧化应激对运动神经元的损伤机制，为研究提供可靠的动物模型[5]。故本研究采用 SOD1G93A转基因小鼠为实验对象，通过电针干预双侧足三里穴、曲池穴，观察小鼠体质量、转棒实验潜伏期的改变，检测脊髓组织铜锌超氧化物歧化酶(Cu, Zn-Superoxide dismutase，SOD1)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)的含量，以及B淋巴细胞瘤基因-2相关X蛋白(BCL2-Associated X，Bax)和B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl2)的表达，探讨电针干预调控脊髓抗氧化酶水平以及抗细胞凋亡水平，从而保护神经元，改善ALS运动功能及症状，提高存活率的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SOD1G93A转基因小鼠24只，同窝阴性小鼠12只，12周龄，体质量(20±3) g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，合格证编号：SCXK(苏)2016-0010。动物实验过程严格遵守国家实验动物管理条例规定，所有SOD1G93A转基因鼠均饲养于明暗交替(12小时/12小时)、恒温(25±2)℃、恒湿(50%～70%)、无特定病原菌(specific pathogen free, SPF)环境中，以灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料和无菌水饲养。

1.2 实验试剂与仪器

一次性无菌针灸针(0.30 mm×15 mm，苏州医疗用品厂有限公司)；SDZ-Ⅱ型电子针疗仪(苏州医疗用品厂有限公司) ；小鼠固定器(众实科技，批号：1056714)。SOD1测定试剂盒(南京建成，批号：A001-2-2)；GSH-Px试剂盒(南京建成，批号：A005-1-1)；Anti-Bcl-2 (北京博奥森，批号：bs-4563R)；Anti-Bax(北京博奥森，批号：bs-0127M)；山羊抗鼠IgG(北京鼎国昌盛，批号：SH-0011)。PVDF转印膜(美国Thermo Fisher公司)；石蜡切片机(德国SLEE公司)；显微镜(日本OLTMPUS公司) ；电子天平(上海精密仪器仪表有限公司)。

1.3 分组与干预方法

SOD1G93A转基因小鼠24只按照对照随机数字表法分为电针组、模型组，每组12只，同窝阴性小鼠12只作为空白组。根据《常见实验动物穴位图谱》足三里穴定位：在膝关节外侧、腓骨小头下3.5 mm，直刺2 mm；曲池穴定位：位于桡骨近端的关节外侧前方的凹陷中，直刺2毫米。电针组针刺双侧足三里穴、曲池穴后，采用1 mA，2 Hz断续波，持续刺激1分钟，后留针15分钟，不作任何手法；空白组及模型组采取同样抓取手法并固定15分钟。三组均于每日上午干预1次，每周5次，周六、周日不予针刺，连续干预4周。

1.4 观测指标及检测方法

1.4.1 体质量 SOD1G93A转基因小鼠早期体质量下降主要是由于运动神经元的丢失导致肌肉萎缩而致。3组小鼠分别于干预前1天及干预1周、2周、3周、4周末干预结束后进行体质量测量，每只测量3次，取平均值[6]。

1.4.2 转棒实验 也称潜伏期，主要观察小鼠在转棒仪器上停留时间，用于评定小鼠协调性及肌力。转棒仪转速为15 r/min，超过200秒按照200秒记录，不足200秒则按照实际时长记录。实验前对小鼠进行1周适应性训练。测试时间为干预前1天及干预1周、2周、3周、4周末干预结束后，记录小鼠每次潜伏期的时间，每只小鼠重复测量3次，每次间隔15分钟，取平均值。

1.4.3 取材与检测 三组小鼠完成最后1次干预、测量体质量，并禁食24小时(正常饮水)后，每组随机取6只使用冰PBS和4%多聚甲醛进行小鼠全身固定灌流，取脊髓腰4～5节段组织置于4%多聚甲醛后固定。采用免疫组化法，观察SOD1G93A转基因小鼠脊髓组织Bax、Bcl2阳性细胞表达。每组剩余6只小鼠予10%水合氯醛(3.5 mL/kg) 腹腔注射麻醉，断头处死，于冰块上迅速剪取脊髓腰4～5节段组织，放入冻存管中，并保存于-80℃的冰箱备用。利用比色法，检测SOD1G93A转基因小鼠脊髓组织 SOD1、GSH-Px的含量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 电针干预对ALS小鼠体质量的影响

干预期间，空白组体质量呈增加趋势；电针组较模型组减轻幅度小，但均较空白组体质量明显减轻，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明电针干预后，SOD1G93A转基因小鼠体质量得到了一定的保持或增加，因运动神经元的丢失而导致的肌肉萎缩得到了一定的改善。见表1。

表1 各组ALS小鼠电针干预前后体质量比较

2.2 电针干预对ALS小鼠潜伏期的影响

模型组、电针组较空白组潜伏期均缩短(P<0.05)；电针组较模型组停留时间长，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明电针干预后，SOD1G93A转基因小鼠运动功能得到一定的改善。见表2。

表2 各组ALS小鼠电针干预前后转棒实验潜伏期比较

2.3 电针干预对ALS小鼠脊髓组织SOD1、GSH-Px含量的影响

与模型组相比，电针组SOD1、GSH-Px表达明显升高(P<0.05)，但仍显著低于空白组(P<0.05)。表明电针干预可能通过增加SOD1、GSH-Px的表达，抗氧化应激，抑制神经元进一步损伤，进而改善SOD1G93A转基因小鼠疾病的状态。见表3。

表3 各组ALS小鼠电针干预前后脊髓组织SOD1、GSH-Px含量的比较

2.4 电针干预对ALS小鼠脊髓组织Bax、Bcl-2表达的影响

干预结束后，Bax 在各组小鼠脊髓中均有表达。与空白组相比，模型组与电针组Bax阳性细胞计数均明显升高，平均灰度值降低 (P<0.05)，表明SOD1G93A小鼠脊髓腰4～5节段中细胞凋亡相关酶增多。与模型组相比，电针组脊髓中Bax 阳性表达降低，平均灰度值增高(P<0.05)。同时，电针干预4周后出现脊髓中抗细胞凋亡基因Bcl-2 增加的现象(如图2)，表明各组小鼠Bcl-2 在脊髓中均有表达。与空白组相比，模型组与电针组Bcl-2 阳性细胞计数均明显降低，平均灰度值升高(P<0.05)，表明SOD1G93A小鼠抗细胞凋亡基因减少。与模型组相比，电针组Bcl-2 阳性表达增高，平均灰度值降低(P<0.05)，表明电针干预可能通过降低Bax的表达，升高Bcl-2的表达，抑制细胞凋亡，改善SOD1G93A转基因小鼠疾病的状态。(见图1、图2)

3 讨论

中医古籍无ALS的相关记载，大多数医家以其进行性的肌无力、肌萎缩等主要临床表现，将其归入“痿病”的范畴。《素问·痿论篇》:“论言治痿者，独取阳明何也?”《灵枢·根结》曰:“太阳为开，阳明为阖，少阳为枢……故痿疾者，取之阳明。”张介宾云：“阳明虚则血气少，不能润养宗筋……故足痿为用，此所以当治阳明也。”可见“治痿独取阳明”理论是针灸治疗痿证的核心内容之一。历代医家无不以此为治疗痿证之理论，遣方用针之临床指南。在此理论基础之上，应用针灸方法治疗运动神经元病，如ALS等，取得了一定的临床疗效。临床实践证明，针刺以阳明经足三里、曲池为主穴，具有通经络、益脾胃、强筋骨、润肌肉之功效[7-9]。本实验即以“治痿独取阳明”为理论基础，取双侧足三里穴、曲池穴，以电针代替人工手法操作，减少人为操作的误差。

现代医学认为ALS的发病与多种因素有关，而氧化应激是主要发病因素之一。在ALS患者尸检中发现脊髓和大脑运动皮层中羰基衍生物水平明显升高，提示ALS患者神经系统中存在氨基酸的直接氧化[10]。正常人体内会不断产生和消除各类活性氧基团，而ALS患者由于基因突变等因素导致体内自由基过度积累，同时抗氧化系统清除能力下降，从而引起氧化应激反应[11]。中枢系统所含抗氧化物总量相对不足，耗氧量高，细胞膜含有大量不饱和脂肪酸及具有氧化还原活性金属离子，在发生氧化应激时，神经细胞易首先受到损伤，从而引起ALS的各种症状[12]。SOD1占SOD总量的86%，是生物内源性抗氧化剂，可通过歧化作用清除体内超氧阴离子自由基， 减轻细胞损伤， 在维持细胞膜的结构和功能中起着十分关键的作用[13-14]。而GSH-Px作为活性过氧化氢的清除剂，可加强SOD1保护细胞膜结构和功能完整的作用[15]。实验结果表明，与空白组相比，模型组小鼠体质量明显降低，潜伏期也明显缩短，同时脊髓组织中抗氧化酶SOD、GSH-Px的表达明显偏低，说明SOD1G93A转基因小鼠随着发病时间的进展，体内确实存在氧化应激。电针干预可显著提高SOD1、GSH-Px的含量，使失衡的氧化/抗氧化酶系统趋于正常，从而减轻氧化损伤，保护神经元。Bax、Bcl-2是一对凋亡与抗凋亡的基因表达的蛋白，共属Bac-2基因家族。Bcl-2与Bax蛋白水平的高低与凋亡调控直接相关，Bcl-2是细胞凋亡的抑制基因，而Bax拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，且具有促进细胞凋亡的功能。Bax与Bcl-2共存于线粒体，Bcl-2与Bax蛋白可形成同二聚体，也可相互作用形成异二聚体。其中，Bax自身可组成同二聚体，而Bcl-2必须结合Bax形成异二聚体，从而阻抑凋亡[16]。Bcl-2基因所编码的蛋白质属于胞内膜整合蛋白，它对大多数因素诱导的细胞凋亡具有拮抗作用。而Bcl-2蛋白能够影响活性氧水平，可有效清除氧自由基，减轻细胞的损伤[17-18]。同时Bcl-2能促进谷胱甘肽进入核内，改变核内氧化还原状态，从而抑制凋亡[19-20]。电针干预足三里穴和曲池穴可使Bax表达降低、Bcl-2表达升高，提高了脊髓组织抗细胞凋亡能力，从而减少神经元的凋亡。

注：A 空白组;B 模型组;C 电针组

注：A 空白组;B 模型组;C 电针组

综上所述，电针干预足三里穴和曲池穴可改善SOD1G93A转基因小鼠的运动功能，提高脊髓组织对活性氧诱导神经细胞凋亡的负性调节作用，抑制神经元的凋亡，从而有效发挥对神经元的保护作用，减少神经元损伤，起到早期治疗ALS的效果，对ALS早期临床防治具有重要意义。