雷虹 ，张叶 ，肖伟利 ，苏宏泉 ，杨宏昕

（1.内蒙古自治区人民医院药学处，呼和浩特 010017；2.河套学院医学系，巴彦淖尔 015000；3.内蒙古自治区人民医院检验科，呼和浩特 010017；4.内蒙古自治区人民医院中医科，呼和浩特 010017）

糖尿病肾病是糖尿病最重要的合并症，目前已成为导致终末期肾脏病的重要因素[1]。血糖过高引起肾脏损害的机制主要是促进肾小球基底膜增厚和细胞外基质蓄积，损害肾小球等微血管[2]，主要表现为尿量增多、蛋白尿等[3]。甘露消渴胶囊组方为熟地黄、生地黄、枸杞子、地骨皮、山茱萸、玄参、人参、党参、黄芪、菟丝子、天花粉、当归、黄连、白术、桑螵蛸、天冬、麦冬、泽泻、茯苓。功能滋阴补肾，健脾生津，临床上主要用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病[4]。本研究旨在观察甘露消渴胶囊对糖尿病肾病大鼠的影响，以期为甘露消渴胶囊在临床上用于治疗糖尿病肾病提供实验依据。

1 材料及方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠70只，体质量180～220 g，购于内蒙古大学生命科学学院实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（蒙）2016-0001。大鼠饲养于内蒙古医科大学新药安全评价研究中心，实验动物使用许可证号SYXK（蒙）2014-0003，屏障系统内温度20～25℃，湿度40%～50%，每日光照12 h，光暗循环，实验期间大鼠自由摄食饮水。

1.2 受试药物及试剂 甘露消渴胶囊购于吉林省正和药业集团股份有限公司，批号：180412，规格：每丸质量0.3 g，口服，每日3次，每次5粒。盐酸二甲双胍片，购于中美上海施贵宝制药有限公司，口服，每日 2次，每次 1片，每片 0.5 g，批号：abh5048。缬沙坦胶囊：诺华制药有限公司，口服，每日2次，每次1粒，每粒80 mg，批号：Z2702。TMS-P超敏试剂盒，批号：180625391h；DAB显色试剂盒，批号：1807240031B，以上试剂购于福建迈新生物技术开发有限公司。蛋白质酪氨酸激酶JAK2抗体（JAK2），批号：bs-0908R；信号转导和转录激活因子3单克隆抗体（STAT3），批号：bsm-33218M，以上抗体购于北京博奥森生物技术有限公司。柠檬酸，批号：20180521；柠檬酸三钠，批号：20180604；磷酸盐缓冲溶液（PBS），批号：20180527；无水乙醇，批号：20180613；水合氯醛，批号：20171211；二甲苯（AR级），批号：20170801，以上试剂购于国药集团化学试剂有限公司。链脲佐菌素（STZ），批号：SLBB8126V，美国Sigma公司。尿蛋白定量测试盒，批号：180621；尿素氮 （BUN）测试盒，批号：180617；肌酐（Scr）测定试剂盒，批号：180315，以上试剂均购于南京建成生物工程研究所。胆固醇，批号：20180811；胆酸钠，批号：20180107，以上试剂购于成都华夏化学试剂有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组、造模、给药 70只雄性SPF级SD大鼠，随机选取10只为空白对照组，其余大鼠用高脂高糖饲料（普通饲料66.5%，猪油10%，蔗糖15%，蛋黄7%，胆酸钠0.5%，胆固醇1%。）喂养4周[5]。4周后大鼠禁食12 h，除空白对照组外其余大鼠腹腔注射经0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH=4.0）配置的STZ（11 mg/mL，5 mL/kg）[6]。继续维持饲养 4 周后，连续3次随机血糖＞16.7 mmol/L且24 h尿蛋白≥30 mg/L即为造模成功[7]。本研究中60只造模大鼠，有42只大鼠造模成功，将造模成功的大鼠随机分为4组，分别为模型组10只、甘露消渴胶囊低剂量组（0.93 g/kg生药）11只、甘露消渴胶囊高剂量组（1.86 g/kg生药）11只、二甲双胍合并缬沙坦组（180mg/kg，14.4mg/kg）10只。各给药组灌胃体积为10 mL/kg，空白对照组及模型组灌胃等体积蒸馏水，治疗给药8周后测24 h尿蛋白，尾静脉采血测随机血糖，10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，腹主动脉取血，检测血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），最后取肾脏福尔马林溶液固定，用于苏木精-伊红（HE）染色及免疫组化技术检测JAK2及STAT3在肾组织的表达。

1.3.2 苏木精-伊红（HE）染色方法 肾组织经福尔马林溶液固定24 h后从固定液中取出脱水，石蜡包埋，制作2 μm石蜡切片，进行HE染色。观察各组大鼠肾脏病理改变[8]。

1.3.3 免疫组化法测定肾脏JAK2及STAT3表达 取相同部位肾组织，石蜡包埋，制作5 μm石蜡切片，切片脱蜡至水。3%H2O2室温孵育5 min，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，10%山羊血清室温封闭孵育 10 min，倾去血清，滴加一抗（JAK2 1∶200；STAT3 1∶250），4 ℃孵育过夜，PBS 冲洗，滴加生物素标记的二抗，37℃孵育15 min，PBS冲洗，滴加适量的辣根酶标记的链霉卵白素工作液，于37℃孵育15 min，PBS冲洗，DAB显色剂显，5 min，蒸馏水冲洗，苏木精复染，脱水，透明，封片。免疫组化图片采用ImageJ软件进行灰度值分析，根据灰度值计算光密度值（OD），OD=log[gv0/gv）][9]。

1.4 统计学方法 所有数据采用SPSS 22.0统计处理，结果以均数±标准差（±s）表示，组间两两比较采用LSD检验，相关性分析采用Pearson线性相关。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 甘露消渴胶囊对糖尿病肾病大鼠随机血糖的影响 与空白对照组比较模型组随机血糖显著升高（P<0.01），与模型组比较甘露消渴胶囊低剂量组、甘露消渴胶囊高剂量组、二甲双胍合并缬沙坦组随机血糖显著降低（P<0.01）。见表1。

表1 甘露消渴胶囊对糖尿病肾病大鼠随机血糖的影响（±s）Tab.1 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on random blood glucose of diabetic nephropathy rats（±s）

表1 甘露消渴胶囊对糖尿病肾病大鼠随机血糖的影响（±s）Tab.1 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on random blood glucose of diabetic nephropathy rats（±s）

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

组别 动物数 剂量 治疗后随机血糖（mmol/L）空白对照组 10 - 5.34±0.51模型组 10 - 21.34±1.43*甘露消渴胶囊低剂量组 11 0.93 g/kg生药 17.98±1.80#甘露消渴胶囊高剂量组 11 1.86 g/kg生药 16.43±1.22#二甲双胍合并缬沙坦组 10 180 mg/kg，14.4 mg/kg 14.24±2.00#

2.2 甘露消渴胶囊对糖尿病肾病大鼠尿蛋白、血Scr及血BUN的影响 与空白对照组比较模型组尿蛋白、血Scr及血BUN含量显著增加（P<0.01）。与模型组比较甘露消渴胶囊低剂量组、甘露消渴胶囊高剂量组和二甲双胍合并缬沙坦组尿蛋白、Scr及BUN含量显著降低（P<0.01）。见表2。

表2 甘露消渴胶囊对糖尿病肾病大鼠尿蛋白、Scr及BUN的影响（±s）Tab.2 Effects of Ganlu Xiaoke Capsule on urinary protein，Scr and BUN in diabetic nephropathy rats（±s）

表2 甘露消渴胶囊对糖尿病肾病大鼠尿蛋白、Scr及BUN的影响（±s）Tab.2 Effects of Ganlu Xiaoke Capsule on urinary protein，Scr and BUN in diabetic nephropathy rats（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

组别动物数剂量尿蛋白（mg/L）Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）空白对照组 10 - 8.22±1.07 41.10±5.39 6.21±1.07模型组 10 - 49.82±3.01* 69.92±3.01* 12.49±0.82*甘露消渴胶囊低剂量组 11 0.93 g/kg生药 38.76±3.79# 54.76±3.79# 8.17±0.68#甘露消渴胶囊高剂量组 11 1.86 g/kg生药 32.51±2.57# 52.51±2.57# 8.40±0.78#二甲双胍合并缬沙坦组 10 180 mg/kg，14.4 mg/kg 29.91±4.20# 49.91±4.20# 8.62±1.33#

2.3 甘露消渴胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏组织病理损伤的影响 肾脏HE染色结果显示空白对照组大鼠肾小球大小正常，形态规整，肾间质未见炎症浸润，系膜区无可见增生，肾小管结构完整，排列整齐；模型组大鼠肾脏的肾小球明显增大，系膜细胞增殖，系膜基质增加，肾小管上皮细胞存在空泡（图中黑色尖头所指处）；与模型组比，甘露消渴胶囊低剂量组、甘露消渴胶囊高剂量组及阳性药物对照组大鼠肾小球形态趋于正常，基底膜轻微增生，肾小管排列趋于完整，较模型组病变程度明显减轻，见图1。

图1 甘露消渴胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏病理损伤的影响（×400）Fig.1 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on renal pathological damage in diabetic nephropathy rats(×400)

2.4 甘露消渴胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏组织JAK2及STAT3表达的影响 与空白对照组比较，模型组肾脏组织JAK2及STAT3表达显著增加（P<0.01）。与模型组比较，甘露消渴胶囊低剂量组、甘露消渴胶囊高剂量组和二甲双胍合并缬沙坦组肾脏组织JAK2及STAT3表达显著降低（P<0.01）。见表 3、图 2、图 3。

图2 甘露消渴胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏组织JAK2表达的影响（×400）Fig.2 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on JAK2 expression in kidney tissue of diabetic nephropathy rats(×400)

图3 甘露消渴胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏组织STAT3表达的影响（×400）Fig.3 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on expression of STAT3 in kidney tissue of diabetic nephropathy rats(×400)

表3 甘露消渴胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏组织JAK2及STAT3表达的影响（±s）Tab.3 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on expression of JAK2 and STAT3 in kidney tissue of diabetic nephropathy rats（±s）

表3 甘露消渴胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏组织JAK2及STAT3表达的影响（±s）Tab.3 Effect of Ganlu Xiaoke Capsule on expression of JAK2 and STAT3 in kidney tissue of diabetic nephropathy rats（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

组别 动物数 剂量 JAK2 OD值 STAT3 OD值空白对照组 10 - 0.128±0.020 0.098±0.019模型组 10 - 0.329±0.017* 0.301±0.019*甘露消渴胶囊低剂量组 11 0.93 g/kg生药 0.252±0.023# 0.222±0.032#甘露消渴胶囊高剂量组 11 1.86 g/kg生药 0.230±0.023# 0.203±0.020#二甲双胍合并缬沙坦组 10 180 mg/kg，14.4mg/kg 0.186±0.020# 0.179±0.035#

2.5 各组大鼠随机血糖与尿蛋白、Scr、BUN、JAK2及STAT3表达的相关性分析 Pearson相关分析显示各组大鼠随机血糖与24 h尿蛋白量、血BUN含量、血Scr含量、JAK2及STAT3在肾组织的表达之间具有相关性，呈正相关（P＜0.01）。见表4。

表4 各组组大鼠随机血糖与尿蛋白、Scr、BUN、JAK2及STAT3表达相关性分析Tab.4 Correlation analysis of random blood glucose and urinary protein，Scr，BUN，JAK2 and STAT3 expression in each group

3 讨论

糖尿病肾脏病变是糖尿病最严重的并发症，其主要病变为肾小球硬化症，糖尿病肾脏病是以血管损害为主的肾小球病变[10]。糖尿病的早期肾脏体积增大，肾小球呈高滤过状态，肾小球组织蛋白的非酶糖化可改变肾小球基底膜和系膜区基质蛋白的特性，使肾小球基底膜通透性增加、肾小球基底膜增厚[11]。逐渐出现微量白蛋白尿，随着糖尿病病程的延长出现持续蛋白尿、肾小球滤过率降低等症状[12]。控制血糖可改善异常的肾血流动力学，延缓微量蛋白尿的出现，使已有微量蛋白尿的患者转为明显临床蛋白尿的情况明显减少。高血压是导致糖尿病肾病发生和发展的重要因素。血管紧张素转化酶抑制剂，可以改善肾内血流动力学、减少尿蛋白排出，抑制系膜细胞、成纤维细胞和巨噬细胞活性，改善滤过膜通透性[13]。甘露消渴胶囊由熟地黄、生地黄、枸杞子、地骨皮、山茱萸、玄参、人参、党参、黄芪、菟丝子、当归、黄连、天花粉、白术、桑螵蛸、天冬、麦冬、泽泻、茯苓组成，有研究表明其中的天花粉、地骨皮、泽泻、黄连具有明确的降血糖作用；地骨皮、山茱萸具有可靠地降血压作用，人参、党参、黄芪、当归具有显著的预防血管损伤及改善微循环的作用，以上药理作用均能有效延缓糖尿病肾脏病的发生、发展。糖尿病肾病发病机制尚未完全阐明，近年来炎症反应在其发病机制中的作用受到重视，高血糖可使肾实质细胞合成多种细胞因子如结缔组织生长因子、胰岛素样生长因子-1、肿瘤坏死因子、白介素-6（IL-6）等[14]，其中 IL-6 与细胞膜上 IL-6 受体结合后能诱导JAK2/STAT3信号通路的活化，进而促进炎症反应的发生并促进血管内皮细胞的增殖，引起肾小球血管通透性增强，肾小球的滤过膜损伤。肾小球损伤后产生蛋白尿诱使肾小球增殖肥大的形成。本研究表明甘露消渴胶囊可显著降低糖尿病肾病大鼠JAK2及STAT3在肾脏组织表达，减轻糖尿病引起的肾小球增大及基底膜增生，降低尿蛋白、Scr及BUN含量，且上述药理作用均与甘露消渴胶囊降低血糖作用呈正相关。

综上所述，甘露消渴胶囊可通过降低糖尿病大鼠随机血糖以及调控JAK2、STAT3在肾脏组织的表达，减轻高血糖对肾组织的病理损伤，改善肾功能，起到对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用的作用。