郭宣利， 王 玉， 王文廉*

(1.中北大学仪器科学与动态测试教育部重点实验室，山西太原 030051；2.中北大学电子测试技术国家重点实验室，山西太原 030051)

四环素(Tetracycline,TC)因为价格低且有较强的抗菌能力，被广泛应用于畜牧业、水产养殖以及感染性疾病的预防和治疗[1]。然而，过量添加四环素类药物会造成其在肉类、牛奶、蜂蜜等动物源性食品中较高残留，严重影响人体骨骼和牙齿[2]发育，对肾脏也有损伤[3]。世界卫生组织和欧盟规定牛奶中四环素最大残留限量(MRL)为100 mg/L。所以建立一种可以快速便捷的测量食品、药物中的四环素含量的方法具有重要意义。目前四环素的检测主要有分光光度法[4]、高效液相色谱法[5]、化学发光法[6]、微生物法[7]、免疫法[8]和毛细电泳法[9]等方法。

分子印迹技术(Molecular Imprinting,MIT) 对特定目标分子具有选择特异性，在分子识别、固相萃取、色谱分离等方面得到广泛应用。金属纳米颗粒,诸如Au、Pt、Ag、Cu、Ni已经成为最热门的增加电化学活性的电催化剂[10]。Au纳米粒子(Au NPs)的比表面积大，用它作为增敏材料可有效提高电化学传感器的灵敏度、生物相容性[11]以及稳定性。Cu纳米粒子(Cu NPs)对一些生物分子具有很好的催化氧化[12]性能。Garaj等研究表明，合金纳米粒子展现出多功能性和良好的协同性,它们在基础研究和应用上比相对应的单一的金属更具优势[13]。近些年柔性可穿戴器件发展迅速，人们对于柔性电极的需求更加迫切。碳布(Carbon Cloth,CC)是制作柔性电极中最具有吸引力的材料之一[14]，它导电性良好，比表面积大，热稳定性高，而且柔韧性好，耐磨，价格低。

本文用H2SO4作为活化剂活化碳布，使其更加柔软且性能稳定。在碳布表面修饰Au-Cu NPs复合纳米粒子作为工作电极测量四环素，与传统玻碳电极相比电流响应显著增强，同时抗干扰性和重复性良好，可用于牛奶中四环素的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI600E电化学分析仪(上海辰华有限公司)；KQ-500DE超声波清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司)；DHG-9013A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；BSA224S-CW电子天平(上海一恒科学仪器有限公司)；TG16-WS(磁力搅拌器上海实验仪器有限公司)；SU-8010型扫描电子显微镜(日本，JEOL公司)。

四环素、卡那霉素、氯霉素、土霉素均购于百灵威试剂有限公司；邻苯二胺购于Adamas(上海)有限公司；HAuCl4购于北京化学试剂有限公司；CuSO4、K3[Fe(CN)6]、H2SO4、KCl、甲醇、无水乙醇购于国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。实验用水为去离子水。

1.2 柔性分子印迹传感器的制备

1.2.1 碳布的活化将碳布裁剪成1 cm×2 cm，用去离子水冲洗干净。将洗干净的碳布依次在丙酮、无水乙醇、去离子水中各超声清洗15 min，然后放入H2SO4∶HNO3(体积比1∶3)混酸中浸泡过夜，次日取出用大量去离子水冲洗后，用碳布作为工作电极，在三电极体系下，将电极置于2 mol/L的H2SO4中，用循坏伏安法(CV)在0～2 V电位范围内，以20 mV/s的扫速扫描20圈，取出用去离子水冲洗干净得到酸化碳布(ACC)。

将酸化碳布放入烘箱干燥后，为了控制有效工作面积，在碳布1 cm×1 cm范围上方涂覆一圈指甲油，然后用医用胶带包裹住。将电极在磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.01 mol/L)中循坏伏安扫描，直到曲线稳定后，活化电极制备成功，放置备用。

1.2.2 分子印迹传感器的制备将碳布、Ag/AgCl电极、铂网电极三电极浸入50 mmol/L H2SO4和20 mmol/L苯胺的混合溶液中，然后以25 mV/s的扫描速度进行循环伏安扫描，扫描结束取出聚苯胺(PAIN)/CC电极，去离子水洗涤，60 ℃下干燥备用。将制备好的PANI/CC电极浸入含有10 mmol/L HAuCl4、1 mol/L H2SO4和5 mmol/L CuSO4混合溶液中，然后通氮气保存30 min，再在-0.6 mA/cm2的电流密度下聚合900 s，聚合过程中用磁子不断搅拌。聚合结束取出电极，用大量去离子水冲洗，60 ℃下干燥，得到Cu-Au NPs/PANI/CC修饰电极。

以0.01 mol/L PBS配制含1 mmol/L四环素、5 mmol/L邻苯二胺的混合溶液。将Cu-Au NPs/PANI/CC放在混合溶液中，利用循环伏安法在0～0.8 V的电位下，以50 mV/s的扫速，扫描40圈(期间对混合溶液进行缓慢的磁力搅拌)。将电聚合后的电极放在甲醇∶乙酸(体积比9∶1)洗脱液中洗脱10 min，除去模板分子四环素，即可得到四环素分子印迹电极(Au-Cu NPs/PANI/TC/CC)。

1.3 实验方法

配制20 mL含有不同浓度四环素的0.1 mol/L PBS，将Au-Cu NPs/PANI/TC/CC修饰电极在配制好的溶液中孵育10 min后，在0.01 mol/L PBS中，利用差分伏安法(DPV)在0～0.6 V电位下扫描，记录不同浓度四环素所对应的DPV峰值电流。

2 结果与讨论

2.1 纳米材料的表征

2.1.1 纳米材料的扫描电镜表征使用扫描电镜(SEM)表征柔性传感器的形貌。图1A为未修饰碳布的SEM图，从图中可以看出碳布的管状结构。图1B为修饰过纳米复合粒子的碳布传感器SEM图，可以看出，碳布的管状结构上附着了纳米级的颗粒结构，说明纳米材料修饰成功，即Cu-Au NPs/PANI/CC传感器制备成功。

图1 修饰纳米复合材料前(A)后(B)的碳布扫描电镜(SEM)图Fig.1 SEM images of carbon cloth before(A) and after(B) modification with nanocomposite

2.1.2 纳米材料的电化学特性为了检测活性材料的电催化能力，在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液和0.1 mol/L KCl溶液中，分别对裸碳布和Cu-Au NPs/PANI/CC修饰电极进行循环伏安测试，扫描速度为50 mV/s。结果如图2所示。从图中可以看出，未修饰纳米复合材料的碳布电极的电流响应明显低于修饰纳米复合材料后的碳布电极，说明纳米复合材料对碳布电极有明显的电催化作用。

图2 在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl溶液中碳布电极镀材料前(a)和后(b)的循环伏安图Fig.2 Cyclic voltammograms of carbon cloth electrodes before(a) and after(b) plating materials in 5 mmol/L K3[Fe(CN)6] and 0.1 mol/L KCl solutions

2.2 实验条件的优化

2.2.1 碳布活化溶液分别用H2SO4和KOH溶液对碳布进行改性，比较后选择出较好的活化方式。碱性活化在1 mol/L的KOH溶液中用阳极极化法在2.0 V 的电位下扫描200 s，其他步骤同酸化碳布的处理进行制备。比较碱化碳布、酸化碳布的电化学响应，发现酸化碳布的响应电流更大。所以本文采用酸化法对碳布进行活化。

2.2.2 沉积电流与时间采用DPV法研究沉积电流和沉积时间的影响。实验结果表明，在沉积电流-0.8～-0.6 mA范围内，峰值电流增大，而沉积电流大于-0.6 mA，峰值电流开始减小。当沉积时间在600～900 s时，峰值电流增大，继续沉积，峰值电流减小。因此，当沉积电流为-0.6 mA，沉积时间为900 s时，响应电流达到最大值。

2.2.3 电聚合圈数在电聚合时可以通过控制聚合圈数来控制分子印迹膜的厚度。利用DPV法记录其峰值实验表明电聚合10～40圈时，峰值电流逐渐变大，电聚合40圈时峰值电流达到最大，当电聚合圈数大于40圈，峰值电流开始减小。

2.2.4 洗脱时间将电极浸泡到甲醇∶乙酸(体积比9∶1)溶液中进行洗脱实验，利用DPV法记录洗脱不同时间后，碳布电极在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl溶液中的电流响应。结果表明，当洗脱时间为10 min时，电流响应增大，当洗脱时间大于10 min时，电流响应开始减小。实验选择最佳洗脱的时间为10 min 。

2.3 标准曲线与检出限

优化实验条件下，将Cu-Au NPs/PANI/TC/CC修饰电极置于不同浓度四环素溶液中孵育10 min后，放入PBS(0.01 mol/L)中进行DPV扫描，记录不同浓度四环素分子印迹传感器在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl溶液中的峰值电流，结果如图3所示。随着四环素浓度增大，响应电流逐渐减小，在浓度1.0×10-7～3.0×10-5mol/L范围内成良好的线性关系，线性方程为：IP=-0.5752lgc+3.6307(IP:10-3A,c:mol/L)，线性相关系数R2=0.9996。信噪比为3时，检出限为2.57×10-11mol/L。

图3 不同浓度的四环素在0.01 mol/L PBS中的DPV曲线以及线性拟合图Fig.3 DPV curve and linear fitting diagram of different concentrations TC in 0.01 mol/L PBS

2.4 抗干扰性和重复性

由于土霉素(OTC)、卡那霉素(KA)、氯霉素(CAP)和四环素(TC)结构相似，因此在四环素溶液中分别加入100倍浓度的上述物质，利用DPV法观察其电流响应，结果见图4。从图中可以看出，加入其它物质对电流响应影响很小，相对标准偏差(RSD)<3.5%,说明抗干扰性良好。

图4 四环素和不同干扰物混合溶液的DPV曲线(A)以及峰值电流大小柱状图(B)Fig.4 DPV curve of mixed solutions of TC and different interference substances(A) and histogram of peak current(B)

将制备的分子印迹传感器连续5 d利用DPV法测定相同浓度的四环素，DPV的峰值电流分别为0.963、0.954、0.961、0.966、0.949，测定结果的RSD<3%，说明传感器的重复性良好。

2.5 实际样品的检测

取10 mL牛奶(购于超市某品牌)与10 mL无水乙醇混合后，超声处理20 min，将混合物离心10 min后，过滤，收集滤液，放在冰箱中(4 ℃)备用。

将分子印迹柔性电极置于含样品的PSB(0.1 mol/L,pH=7.0)中，测定四环素的电流响应值。采用相同的办法制备加标样品溶液(牛奶加标浓度为0.02、0.04、0.06 μmol/L)进行回收实验，并计算回收率和RSD。结果在牛奶样品中并未检测出四环素，3个不同浓度下四环素的回收率为97.3%～105%，RSD为2.1%～4.7%。

3 小结

本文用酸化碳布构建了复合纳米粒子分子印迹传感器，用于对四环素的检测研究。酸化碳布电极更加稳定柔软，比玻碳电极电流响应更大，纳米合金的修饰使碳布电极有更好的电催化特性。四环素的浓度在1.0×10-7～3.0×10-5mol/L范围内与DPV峰电流成良好的线性关系，检出限为2.57×10-11mol/L。该传感器成本低廉，制作简单，柔软稳定，灵敏度高，可用于实际样品中的四环素检测。