贾爽爽　黄晓庆　孔繁芳等

中图分类号：S 481.4 文献标识码：A DOI： 10.16688/j.zwbh.2020248

由灰葡萄孢Botrytis cinerea引起的葡萄灰霉病不仅是葡萄生产中的常见病害，更是产后贮藏期的毁灭性病害，严重影响葡萄的产量和质量，对葡萄产业造成严重的经济损失。目前生產上用于防治该病害的杀菌剂主要有苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、烟酰胺类、苯氨基嘧啶类等。葡萄灰霉病菌产孢量大、易变异，适应性强，随着杀菌剂的频繁、大量使用，该病菌已对多种杀菌剂产生不同程度的抗药性。

多菌灵属于苯并咪唑类内吸性杀菌剂，作用于真菌β-微管蛋白，抑制孢子芽管分隔和菌丝生长。该杀菌剂自20世纪60年代问世以来被广泛用于灰霉病的防治，但其作用位点单一，具有较高的抗性风险。随着该药剂的频繁使用，灰霉病菌已对其产生严重的抗药性。日本、巴西、希腊以及我国多个地区的番茄及草莓上的灰霉病菌均出现了大量抗性菌株。大量研究表明，灰葡萄孢对多菌灵的抗性主要与其靶标基因β-tubulin上的E198A、E198V、E198K、E198G或F200Y突变有关，各个国家或地区检测出的抗性突变类型和比例存在不同，但总体上以E198A和E198V两种抗性突变类型为主。

异菌脲属于二甲酰亚胺类杀菌剂，该杀菌剂可以激活丝状真菌中参与调控菌株对渗透压敏感性的双组分组氨酸激酶信号途径（TCHK信号途径）。研究表明，该途径中的组氨酸激酶OSI元件为二甲酰亚胺类杀菌剂的作用靶标。二甲酰亚胺类杀菌剂的作用位点较多，可使灰霉病菌菌丝和芽管生长受阻，畸形或涨破，从而起到抑制病原菌的作用。随着异菌脲的不断重复使用，灰霉病菌对该杀菌剂逐渐产生了抗药性。美国灰霉病菌的异菌脲抗性频率从2014年的20. 05%上升至2015年的62%。我国很多地区也发现了大量抗异菌脲灰霉菌株，例如，2006年浙江、江苏、山东和辽宁4省的蔬菜灰霉病菌对异菌脲的平均抗性频率为20%左右;2012年江苏草莓灰霉病菌对异菌脲的抗性频率达到64.6%;北京市草莓灰霉病菌对异菌脲的抗性频率由2013年的40.4%上升至2014年的45. 3%，且不同采样点的抗性频率存在明显的不同。随着对灰霉病菌异菌脲抗性机理研究的不断深入，发现灰霉病菌对异菌脲的抗性主要与Bos1基因的I365S、I365N、I365R、Q369P、V368F+Q369H、Q369P+N373S和N373S突变有关。

上述灰霉病菌对多菌灵和异菌脲的抗性报道主要集中在蔬菜及草莓病害上，目前葡萄灰霉病菌相关抗药性研究较少。2019年，郑媛萍等发现山东蓬莱地区的葡萄灰霉病菌对多菌灵和异菌脲的抗性频率均高达90%以上。黑龙江省哈尔滨市和云南省宾川县是我国的主要葡萄产区，多菌灵和异菌脲在这两个地区已使用多年，明确该地区葡萄灰霉病菌对这两种杀菌剂的抗性频率及抗性突变类型，为进一步建立针对这两种药剂抗性的快速分子检测技术及指导当地葡萄灰霉病的有效防控奠定理论基础。

1材料与方法

1.1菌株的采集、分离纯化和保存

2017年从黑龙江省哈尔滨市和云南省宾川县葡萄主要种植区采集葡萄灰霉病果装入自封袋并用冰袋降温带回实验室。在实验室对病样进行分离培养，产孢后使用接种环蘸取少量孢子划线进行分离培养，1d后挑取单个菌落进行培养，两个地区共分离纯化得到葡萄灰霉病菌77株，其中采集自黑龙江省哈尔滨市的菌株共39株，采集自云南省宾川县的菌株共38株，将培养好的菌株打取直径为5mm的菌饼置于40%甘油中于-80℃保存备用。

1.2供试药剂与培养基

98%多菌灵原药和98.4%异菌脲原药均由中国农业科学院植物保护研究所农药应用工艺学研究组提供。多菌灵溶于0.1mol/L的盐酸溶液中，配制成5 mg/mL的母液;异菌脲溶于100%的甲醇，配制成10 mg/mL的母液。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：土豆去皮洗净切成约1cm³的小块，准确称取200g，加入1LddH₂O煮至熟透，过滤后定容至1L，加入20g葡萄糖和20 g琼脂粉，加热并搅拌至完全溶解，用锥形瓶分装后121℃高压灭菌20 min。

1.3葡萄灰霉病菌对多菌灵和异菌脲的抗性频率测定

测定葡萄灰霉病菌对多菌灵和异菌脲的抗性频率，其中多菌灵的鉴别浓度为10μg/mL，异菌脲的鉴别浓度为5μg/mL。在培养2d的菌落边缘打取直径为5mm的菌饼，接种于含药和对照PDA平板上，每个处理重复3次。22℃培养箱L∥D=12 h∥12 h光暗交替培养2d后，观察并记录菌株生长情况。分别统计两个地区葡萄灰霉病菌对多菌灵和异菌脲的抗性频率。抗性频率一抗性菌株数/所测菌株总数×100%。

1.4 β-tubulin基因和Bos1基因序列测定

使用E-Z96真菌基因组DNA提取试剂盒（D3390-02）（OMEGA）提取供试菌株的基因组DNA。使用引物TubA F/R： CGCGAGGAGTTCCCAGAACG/GACGGCGGAAACCAAGTGG和Bos1F/R： AGCCCAGGGTGAGATACTCC/TTTGCGAC-AGCTGTTGTGAC分别扩增上述菌株的β-tubulin和Bos1基因。引物由上海生工生物有限公司合成。PCR扩增体系为40μL，包括14μL ddH₂O、20μL2×Taq Mix，上下游引物各2μL，DNA模板2μL。PCR反应程序为：95℃预变性5 min; 94℃变性30 s，56℃C退火30 s，72℃延伸1min，30个循环;最后72℃延伸10 min。扩增产物的测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，测序结果使用ge-neous软件进行整理和分析。

2结果与分析

2.1葡萄灰霉病菌对多菌灵和异菌脲的抗性频率

黑龙江省的39株葡萄灰霉病菌均对多菌灵产生抗性，抗性频率为100. 0%，有20株对异菌脲产生抗性，抗性频率为51. 3%，对多菌灵和异菌脲的多药抗性频率为51. 3%。云南省的38株葡萄灰霉病菌中有37株对多菌灵和异菌脲均产生了抗性，抗性频率均为97.4%（表1）。

2.2葡萄灰霉病菌對多菌灵的抗性突变

对供试菌株的测序结果表明，所有多菌灵敏感菌株均未检测到β-tubulin基因上的突变，在所有多菌灵抗性菌株中均检测到了E19 8A或E19 8V突变。两个地区的多菌灵抗性突变类型分布不同。在黑龙江省的39株多菌灵抗性菌株中，E19 8A突变株有35株，占比为89. 7%，E19 8V突变株有4株，占比为10. 3%。云南省的37株多菌灵抗性菌株中，E198A突变株有18株，占比为48. 6%，E198V突变株有19株，占比为51.4%（图1）。

2.3葡萄灰霉病菌对异菌脲的抗性突变

对供试菌株的测序结果表明，所有异菌脲敏感菌株均未检测到Bos1基因上的突变，在所有异菌脲抗性菌株中均检测到了I365N、I365S、Q369P+N373S或Q369P突变。两个地区的异菌脲抗性突变类型分布不同。20株采自黑龙江省哈尔滨市异菌脲抗性菌株中，共有I365N、I365S、Q369P+N373S和Q369P 4种突变类型，占比分别为45. 0%、20. 0%、30.0%和5.0%。云南省宾川县的37株异菌脲抗性菌株只有I365N、I365S和Q369P+N373S 3种抗性突变，占比分别为10. 8%、59.5%和29. 7%（图2）。

3结论与讨论

根据文献报道，国内外灰霉病菌已对多菌灵产生较普遍的抗药性。1987年我国就已经发现该病菌对多菌灵具有高度耐药性，且随着多菌灵的频繁使用，抗性频率逐渐上升。2012年—2013年湖北省草莓灰霉病菌对多菌灵的抗性频率为49.32%。2013年2014年长三角地区果蔬灰霉病菌对多菌灵的抗性频率为70.48%。2015年山西省灰葡萄孢对多菌灵的抗性频率为90.32%。国外也对灰葡萄孢的多菌灵抗性进行了诸多报道。2008年—2009年希腊灰葡萄孢对多菌灵的抗性频率为60. 5%。本研究结果表明，黑龙江省和云南省的葡萄灰霉病菌对多菌灵的抗性频率分别到达100. 0%和97.4%，表明多菌灵对这两个地区的葡萄灰霉病菌几乎丧失防效。鉴于对多菌灵抗的抗药性可稳定遗传，建议生产上停止多菌灵的使用，改用其他作用机制不同于多菌灵且抑菌效果好的杀菌剂。

二甲酰亚胺类杀菌剂异菌脲也是生产上防治灰霉病的常用杀菌剂，自20世纪70年代开始使用，到目前为止多地区的多种作物上的灰霉病菌均对该杀菌剂产生了抗药性。国外的异菌脲抗性灰霉病菌发现的较早，在1986年英国的灰霉病菌对异菌脲的抗性频率就已经达到45.3%。美国灰霉病菌的异菌脲抗性频率从2014年的20.05%上升至2015年的62%。我国很多地区也发现了大量抗异菌脲灰霉病菌株。本研究结果中黑龙江省和云南省的葡萄灰霉病菌对异菌脲的抗性频率分别达到51.3%和97.4%，表明上述两个地区的葡萄灰霉病菌对异菌脲抗性频率较高，尤其是在云南宾川县，该药剂几乎失去防效。据报道，灰霉病菌对异菌脲的抗性并不稳定，持久性弱，它可以产生对异菌脲敏感的孢子，使得菌株对异菌脲再次敏感。所以，建议暂停异菌脲的使用或与其他作用机制不同的杀菌剂交替使用，以便使葡萄灰霉病菌恢复对异菌脲的敏感性，延长异菌脲的使用寿命。

对多菌灵和异菌脲的多药抗性研究结果表明，黑龙江省的葡萄灰霉病菌对多菌灵和异菌脲的多药抗性频率达到了较高的水平，为51.3%。云南省的多药抗性频率更高，达到了97.4%，几乎所有的葡萄灰霉病菌对多菌灵和异菌脲均具有抗性。因此，建议生产上两省葡萄产区避免多菌灵和异菌脲同时使用。

本研究发现，黑龙江省和云南省葡萄灰霉病菌的多菌灵抗性突变仅发生在β-tubulin基因的第198位上，有E198A和E198V两种类型，未检测到其他突变。并且E19 8A和E19 8V抗性突变在这两个地区的分布存在明显差异，其中，黑龙江省的大部分多菌灵抗性菌株为E198A突变（89.7%），而云南省这两种突变类型所占的比例相似，推测这可能与南、北地区的气候差异导致不同突变类型菌株的适合度不同有关。Bos-1基因上与灰霉病菌对异菌脲的抗性有关的突变较多，其中I365N和I365S出现的频率相对较高，并且不同地区检测到的抗性突变类型存在差异。而黑龙江省哈尔滨市葡萄灰霉病菌对异菌脲的抗性突变有I365N、I365S、Q369P+N373S和Q369P 4种类型，云南省宾川县有I365N、1365S和Q369P+N373S 3种。两个地区不同抗性突变类型的分布存在差异，其中黑龙江省I365N突变类型所占的比例最大，达到45%;而云南省宾川县的抗性突变类型主要为I365S（59.5%）。

综上所述，黑龙江省和云南省的葡萄灰霉病菌对多菌灵和异菌脲的抗性频率均很高。其中，多菌灵的药效基本丧失，建议生产上立即停止使用;而对异菌脲，建议暂停或者与其他药剂交替使用。这两个地区多菌灵抗性菌株β-tubulin基因存在E198A和E198V两种突变类型;引起异菌脲的抗性突变主要有I365N/S和Q369P 3种，可依据上述靶标突变位点建立相应的抗药性快速分子检测技术，为更大范围内进行葡萄灰霉病菌对多菌灵和异菌脲抗性的检测或监测以及病害的防治奠定理论基础。