卢 瑛

（莱芜职业技术学院，山东莱芜 271100）

生姜蛋白酶（Ginger protease/Zingibain,EC 3.4.22.67）是存在于生姜块状根茎中的一种巯基蛋白酶，有两种GP-I 和GP-II（GPI 和GPII 分别与GenBank 中GP3 和GP2 同源性较高），均含有221 个氨基酸，含有6 个Cys 形成3 个二硫键为糖蛋白，具有蛋白水解活性。生姜蛋白酶能够水解胶原蛋白，可用于肉类嫩化、酒类澄清，乳制品凝固等［1］，以姜汁为添加剂开发的具有新型保健功能的凝固型酸奶，在广东地区颇受欢迎，因此该酶具有良好的工业化应用前景［2］。

生姜蛋白酶的分离纯化工艺操作复杂，而且生姜蛋白酶的含量在不同生姜品种、不同栽培地区及不同气候条件下差异非常大，甚至同一品种的干姜与生姜之间的含量也不相同，导致生姜蛋白酶的提取率不稳定［3］。尤其生姜常年连作导致茎腐病、斑点病和姜瘟病高发，推升了市场上生姜的价格，使得提取生姜蛋白酶的成本升高，进一步限制了生姜蛋白酶的开发利用。

本实验从莱芜生姜中提取总RNA，通过RT-PCR 技术扩增生姜蛋白酶基因，并构建了pET-GPII 原核表达载体，重组质粒在大肠杆菌BL21 中实现了原核表达，为生姜蛋白酶工程化生产进行了探索。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种、质粒和植物材料

大肠杆菌DHB4 和宿主菌BL21 以及质粒pET30a（+）为本实验室保存，莱芜生姜购于莱芜大润发超市。

1.1.2 酶、试剂盒和生化试剂

dNTP、DL2000、EasyTaq DNA 聚合酶、TransStart FastPfu DNA 聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；植物总RNA 提取试剂盒购自北京康为世纪有限公司；T4 DNA 连接酶购自TaKaRa 公司；限制性内切酶KpnI、XbaI、EcoRI 和反转录试剂盒RevertAid Fist Strand cDNA Synthesis Kit 购自ThermoFisher 公司；……