刘继光， 宋 佳， 李秋萍， 赵志宇， 胡建新

(佳木斯大学1.口腔医学院，2.药学院，黑龙江 佳木斯 154007)

0 引 言

氯酚类化合物大多数具有致畸、致癌以及致突变性，其中2,4-二氯酚(DCP)和2,4,6-三氯酚(TCP)因毒性较高一直被美国环保局列入优先控制污染物名单[1]。近来科学研究还发现，很多氯酚类化合物对人类的各种危害中，尤以遗传性疾病和癌症备受关注。目前，国际上用于评价致突因素的常用方法为哺乳动物细胞致突变试验，该试验主要以V79细胞为模型细胞，通过检测细胞中HGPRT基因位点的突变确定受试物的致突性[2]。然而此方法存在周期长，易出现假阴性结果等缺点。近年来，新兴起的细胞电化学是电化学原理、实验方法与细胞、分子生物学技术相结合的一个新的前沿领域，它通过检测细胞内具有电活性物质的电化学信号，反映各种生命过程[3-5]。采用电化学方法研究了DCP与TCP致V79细胞HGPRT基因突变的电化学信号变化特征，为哺乳动物细胞致突变试验电化学新方法的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1V79细胞购于上海细胞库，多壁碳纳米管购于深圳纳米港有限公司，胎牛血清购于Gibco公司，DMEM培养基购于Hyclone公司，2,4,6-三氯酚和2,4-二氯酚购于百灵威科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 V79细胞的培养与处理

V79细胞培养在5 %浓度CO2，温度37 ℃，100 %饱和湿度的细胞培养箱中，使用的培养基为完全培养基(含10 %胎牛血清、1 %非必需氨基酸、谷氨酰胺和双抗)。收集V79细胞后加入适量PH值为7.4的PBS溶液，在水浴恒温50 ℃加热裂解30 min后进行电化学检测[6]。

1.2.2 修饰电极的制备及电化学检测

多壁碳纳米管/离子液体修饰玻碳电极制备，将适量离子液体与多壁碳纳米管混合物均匀涂于玻碳电极表面，室温干燥。电化学检测采用电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)，以三电极体系进行，其中工作电极为多壁碳纳米管/离子液体修饰玻碳电极，Ag/AgCl丝为参比电极，Pt丝为辅助电极[7]。

1.2.3 V79细胞基因突变常规法检测

V79细胞接触受试物3 h后继续培养8d，然后以每皿2×105个细胞接种于100 mm的细胞培养皿内；贴壁后，加6-巯鸟嘌呤使药物浓度达到5μg·mL-1，培养箱培养8-10d，加入甲醇进行细胞固定，15 min后进行染色，计算突变率的同时计算各培养皿的细胞集落数。测定集落形成率，在另一不加6-巯鸟嘌呤的培养皿中接种200个细胞，剩余步骤同上，计算方法同上(注意：集落数：聚集细胞个数≥50为一集落)。溶剂对照组的集落数为100 %，计算受试药物各浓度的相对集落形成率，结果即为受试物产生的细胞毒性。

相对集落形成率 = 实验组集落形成率/溶剂对照组集落形成率

突变率 = 突变集落数/(接种细胞数×集落形成率)

1.2.4 V79细胞HGPRT基因突变的电化学检测

将V79细胞分为受试物组、甲磺酸乙酯(EMS)阳性对照组和二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组。加药3 h后换DMEM完全培养基，每2d传代一次，培养9d，电化学检测时间周期为48 h。

将不同受试物组细胞加入6-硫鸟嘌呤培养8-10d后，换完全培养基继续培养传代2次后，消化计数，获得3×106cells·mL-1完全突变V79细胞，对同浓度完全突变与未突变细胞进行电化学检测。

2 结 果

2.1 常规法检测氯酚类化合物对V79细胞HGPRT基因突变

由表1可知，DMSO溶剂对照组的突变率为6.2×10-6；EMS阳性对照组的突变率为613×10-6；浓度为400 μmol·L-1的氯酚类化合物DCP、TCP的突变率分别为564×10-6和710×10-6；两种化合物的突变率与阳性对照组相近为典型的阳性反应。采用氯酚类化合物DCP和TCP做为受试物，标准致突物EMS为阳性对照组的常规检测法结果符合体外哺乳动物细胞(V79/HGPRT)基因突变试验结果，说明氯酚类化合物DCP和TCP可以致哺乳动物细胞HGPRT基因突变。并且常规检测结果显示同样400μmol·L-1浓度下氯酚类化合物突变率大小顺序为：TCP>DCP。

表1 DCP和TCP对V79细胞HGPRT基因位点突变频率的影响

2.2 双信号电化学法检测氯酚类化合物致V79细胞HGPRT基因突变

采用原位电化学法检测了TCP和DCP对V79细胞的致突变作用。由图1可知，V79细胞在接触浓度为400 μmol·L-1的氯酚类化合物TCP和DCP后，自表达第三天开始，其电化学信号峰的峰高明显高于DMSO溶剂对照组，表达第五天达到最高点，出现与EMS阳性对照组相同的趋势。图2为氯酚类化合物DCP、TCP诱变天数与信号Ⅱ峰高关系图，由图可知，V79细胞在接触受试物后，信号Ⅱ峰高在表达第三天开始明显区别于DMSO溶剂对照组，出现与信号Ⅰ峰高相同趋势。

图1 电化学信号I(0.69 V)随DCP和TCP对V79细胞诱变时间变化图

图2 电化学信号II(1.03 V)随DCP和TCP对V79细胞诱变时间变化图

2.3 完全突变细胞的电化学信号响应

将正常V79细胞在接触不同受试物后培养8天加入6-硫鸟嘌呤筛选出完全突变细胞，检测相同浓度细胞电化学信号变化，见图3。在相同细胞量3×106cells·mL-1的情况下，接触了DCP与TCP的完全突变细胞，电化学信号峰大于正常V79细胞，EMS阳性对照组同样大于正常V79细胞，而DMSO溶剂对照组的电化学信号峰小于正常V79细胞。

图3 完全突变细胞电化学信号强度差异细胞浓度：3×106 cells·mL-1

3 结 语

氯酚类化合物大多数具有致畸、致癌作用。常规哺乳动物细胞致突变试验结果显示，DCP与TCP均具有明显的致突变，且TCP的致突变作用强于DCP。V79细胞接触了氯酚类化合物DCP和TCP后，在表达的第三天受试物组既出现明显高于溶剂对照组电化学信号峰的趋势，并在第五天达到最高点。此趋势与EMS阳性对照组相似。对同细胞量完全突变与未突变细胞进行电化学检测比较，其结果显示，在同样细胞数量下完全突变细胞的电化学信号峰高与EMS阳性对照组相似，均大于正常V79细胞。而未突变细胞的电化学信号峰与DMSO溶剂对照组相似，均小于正常V79细胞。以上结果说明，电化学法可以检测到氯酚类化合物DCP和TCP致哺乳动物细胞HGPRT基因突变的特征性变化，有望发展成为一种新的哺乳动物细胞致突变试验。