李艳艳, 马红悦, 李 玲, 谭 瑶, 庞保平,*, 张 恒

(1. 内蒙古农业大学草原昆虫研究中心, 呼和浩特010020; 2. 正镶白旗草原工作站, 内蒙古正镶白旗013800)

滞育是昆虫面对不良环境而维持种群延续的一种适应性策略，其特征在于呼吸微弱、生殖器官发育缓慢、激素及代谢机制发生变化和抗逆性增强等(Kostál, 2006; Hahn and Denlinger, 2011)。滞育可发生于昆虫任何发育阶段，但对于某一种昆虫滞育只发生于特定的发育阶段。按滞育发生的发育阶段可将滞育分为卵滞育、幼虫滞育、蛹滞育和成虫滞育。卵滞育又称为胚胎滞育，广泛发生于直翅目、半翅目、鳞翅目和双翅目昆虫中，但对于卵(胚胎)滞育的调控机理却了解得很少(Denlingeretal., 2012)。滞育激素(diapause hormone, DH)在家蚕Bombyxmori胚胎滞育中起着重要的调控作用(Yamashitaetal., 2001)，两个基因(cyclindependentkinase2和cdc-2relatedkinase)(Takahashietal., 1998)和ERK/MAPK信号通路(Fujiwaraetal., 2006)被认为在其滞育解除过程中起着重要的作用，该通路也参与了叶甲Atrachyamenetriesi胚胎滞育的调控(Kidokoroetal., 2006b)。在某些昆虫如舞毒蛾Lymantriadispar(Leeetal., 1997)、沙漠蝗Schistocercagregaria(Slama, 2000)和蟋蟀Allonemobiussocius(Reynolds and Hand, 2009) 中，蜕皮激素滴度上升诱导胚胎滞育，而对于澳洲疫蝗Chortoicetesterminifera(Greggetal., 1987)和飞蝗Locustamigratoria(Tawfketal., 2002)却是蜕皮激素滴度下降诱导胚胎滞育，外用蜕皮激素促进了飞蝗卵滞育的解除(Kidokoroetal., 2006a)。Hao等(2017)应用转录组学和蛋白组学技术分析了飞蝗滞育卵和非滞育卵的差异基因和蛋白，结果发现昆虫激素生物合成、胰岛素和过氧化物酶体增殖物激活受体 (peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)信号通路可能在飞蝗卵滞育中起着重要的调控作用。保幼激素(juvenile hormone, JH)在昆虫生长发育、变态及滞育过程中起着重要的调控作用(李胜等, 2004)。目前研究表明，JH缺乏是导致成虫滞育的主要因素，而JH在卵滞育调节中作用却很少了解(Denlingeretal., 2012)。施用JH类似物可促进飞蝗和小翅稻蝗Oxyayezoensis卵滞育的解除，但胚胎发生、着色及骨化不正常(Kidokoroetal., 2006a)。

沙葱萤叶甲Galerucadaurica是一种近年来在内蒙古草原上猖獗成灾的新害虫，发生范围不断扩大，危害日趋严重，主要危害沙葱Alliummongolium、多根葱A.polyrhizum和野韭A.ramosum等百合科葱属植物，给草原畜牧业和草原生态系统造成严重威胁(昊翔等, 2015)。沙葱萤叶甲为一化性专性滞育昆虫，一年发生1代，以卵滞育越冬，越冬卵最早于4月中旬孵化，5月下旬至6月初成虫羽化，取食约1周后，聚集于牛粪、石块及草丛下滞育越夏，整个越夏期间几乎不取食，约3个月后滞育解除，开始取食及产卵越冬，为昆虫滞育研究提供了理想的模式材料(Zhouetal., 2016; 陈龙等, 2018b)。目前关于沙葱萤叶甲滞育的研究主要集中于成虫夏滞育不同阶段生化物质含量的变化(陈龙等, 2018b)、蛋白组学分析(Maetal., 2019)、miRNA分析(Duanetal., 2021)以及滞育相关基因的克隆及表达谱分析等(陈龙等, 2018a, 2019, 2020; 段天凤等, 2020; 李爽等, 2020; 马红悦等, 2020； 李艳艳等, 2021)，而对卵滞育的研究却很少。本实验室前期研究表明，秋季沙葱萤叶甲卵被产出后即进入滞育，必须经过秋末和冬季至少2个月低温或5℃恒温下处理1个月才能解除滞育(Zhouetal., 2016)。本研究对沙葱萤叶甲滞育卵和解除滞育卵进行了转录组测序，挖掘了其差异表达基因，对差异表达基因进行KEGG通路富集分析，揭示了与卵滞育相关的主要代谢及信号通路，为进一步开展卵滞育相关基因的克隆、表达及功能研究奠定了必要的基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2019年9月20日从内蒙古锡林郭勒盟镶黄旗天然草原采集沙葱萤叶甲卵，带回实验室后，部分卵用液氮迅速冷冻后置于-80℃下作为滞育卵(D)保存备用；另一部分卵置于5℃低温培养箱中，2个月后取出用液氮迅速冷冻后置于-80℃下作为解除滞育卵(DT)保存备用(Zhouetal., 2016)。

1.2 cDNA文库构建和转录组测序

沙葱萤叶甲滞育卵和解除滞育卵两类卵的转录组测序工作由北京百迈客生物科技有限公司完成。每类卵转录组测序包括3个生物学重复，每个生物学重复约300粒卵，共构建6个cDNA文库。构建好的文库采用Illumina NovaSeq 6000高通量测序平台进行转录组测序，对测序获得的原始数据(raw data)进行过滤，去除接头序列和低质量read，最终获得高质量序列(clean read)，利用Trinity软件对clean read进行序列拼接与组装，获得unigene。

1.3 差异表达基因分析及注释

采用DESeq软件进行沙葱萤叶甲滞育卵和解除滞育卵样品间的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)分析，差异表达基因分析过程采用公认有效的Benjamin-Hochbery方法对P值进行校正，并采用最终校正后的P值，即FDR(false discovery rate)作为筛选差异表达基因的关键指标，其中FDR<0.01且差异表达倍数(fold change, FC)>2作为差异表达基因的筛选标准，FC表示滞育卵与解除滞育卵样品间基因表达量比值。采用BLAST软件将差异表达基因序列与Nr, Swiss-Prot, GO, COG, KOG, eggNOG4.5和KEGG数据库比对(E-value<1×10-5)，获得相应的注释信息。使用ClusterProfiler进行KEGG通路富集分析，以校正后P值(q)≤0.05为显著富集的KEGG通路。

1.4 差异表达基因的验证

随机选取10个1.3节筛选出的差异表达基因，进行qRT-PCR验证，包括保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase, JHE)、保幼激素诱导蛋白(juvenile hormone-inducible protein, JHIP)、保幼激素酸O-甲基转移酶(juvenile hormone acid O-methyltransferase, JHAMT)、卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor, VgR)、海藻糖酶(trehalase, TRE)、热激蛋白68(heat shock protein 68, HSP68)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FAS)、生长激素诱导的跨膜蛋白(growth hormone-inducible transmembrane protein, GHITM)、己糖激酶2(hexokinase type 2, HK2)和类钙粘蛋白(cadherin-like protein, CAD)基因。在FTC-3000实时荧光定量仪(Funglyn Biotech, 加拿大)上进行qRT-PCR。使用Primer Premier 6.0设计目的基因的引物和内参基因SDHA的引物序列(Tan Yetal., 2017)(表1)。所需引物由上海生工生物有限公司合成，以测序返回样品为cDNA为模板。PCR反应体系(20 μL): GoTaq®qPCR Master Mix 10 μL, cDNA模板2 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL, ddH2O 7.2 μL。反应程序: 95℃预变性2 min; 95℃变性20 s, 60℃退火1 min和72℃延伸30 s, 40个循环；溶解曲线: 95℃ 15 s, 65℃ 15 s, 95℃ 15 s。每类卵样品设3个生物学重复，进行4次技术重复，采用2-ΔΔCt方法计算相对表达量(Livak and Schmittgen, 2001)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 结果

2.1 转录组测序结果

本研究对沙葱萤叶甲滞育卵(3个样本)和解除滞育卵(3个样本)进行转录组测序，共获得44.37 Gb的clean data，转录组原始数据已经上传至NCBI的SRA数据库(登录号: PRJNA675752; 各样本序列登录号: SRR13015776-SRR13015781)，各样品clean data均达到6.84 Gb，G+C含量为37.26%～37.38%，各样品的Q20碱基比例均为100%，Q30碱基比例不少于93.84%；共获得53 389条unigene，平均长度为1 229.72131 bp，N50为2 059 bp，表明测序组装结果准确可靠，可用于进一步分析(表2)。

表2 沙葱萤叶甲滞育和解除滞育卵转录组数据库unigene数据统计Table 2 Summary for unigenes in the transcriptomesof diapause and diapause-terminated eggsof Galeruca daurica

2.2 差异表达基因及注释

以解除滞育卵为对照，在滞育卵与解除滞育卵之转录组间共鉴定到2 145个差异表达基因(DEGs)，其中1 297个上调和848个下调。差异表达基因的注释信息显示，共有1 604(74.78%)个差异基因在至少一个数据库中得到注释信息。其中Nr数据库中注释到的DEGs数目最多为1 555个，占总DEGs的72.49%；eggNOG4.5数据库注释到1 403个(65.41%)；Pfam数据库注释到1 148个(53.52%)；KOG数据库注释到1 028个(47.93%)；Swiss-Prot数据库注释到891个(41.54%)；KEGG数据库注释到727个(33.89%)，GO数据库注释到648个(30.21%)，COG数据库注释到533个(24.85%)。

2.3 差异表达基因的KEGG富集

差异表达基因的KEGG通路富集分析表明，上调的DEGs富集于124条通路，主要富集通路(P<0.05)有20条(图1: A)，其中仅有核糖体(ribosome)通路显著富集(q<0.05)。下调的差异表达基因富集于73条通路(图1: B，仅显示前20个富集通路)，主要富集通路(P<0.05)包括MAPK信号通路-果蝇(MAPK signaling pathway-fly)、糖胺聚糖生物合成-硫酸乙酰肝素/肝素(glycosaminoglycan biosynthesis-heparan sulfate/heparin)、凋亡-多物种(apoptosis-multiple species)、Hippo信号通路-果蝇(Hippo signaling pathway-fly)、细胞凋亡-果蝇(apoptosis-fly)、FOXO信号通路(FOXO signaling pathway)、过氧化物酶体(peroxisome)、糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素/硫酸皮肤素(glycosaminoglycan biosynthesis-chondroitin sulfate/dermatan sulfate)和Hedgehog信号通路-果蝇(Hedgehog signaling pathway-fly)等，其中MAPK信号通路和糖胺聚糖生物合成通路显著富集(q<0.05)。

图1 沙葱萤叶甲滞育卵与解除滞育卵转录组间上调(A)和下调(B)差异表达基因的KEGG通路富集分析Fig. 1 KEGG pathway enrichment analysis of the up-regulated (A) and down-regulated (B) differentially expressed genes (DEGs) in the transcriptomes between diapause eggs and diapause-terminated eggs of Galeruca daurica

KEGG富集分析还表明，17个差异表达基因富集于脂肪酸生物合成(fatty acid biosynthesis)和脂肪酸降解(fatty acid degradation)通路(表3)，7个差异表达基因与保幼激素信号相关(表4)。

表3 沙葱萤叶甲滞育卵与解除滞育卵间转录组中与脂肪酸生物合成和降解相关的差异表达基因Table 3 Differentially expressed genes related to fatty acid biosynthesis and degradation in the transcriptomesof diapause eggs and diapause-terminated eggs of Galeruca daurica

表4 沙葱萤叶甲滞育卵与解除滞育卵间转录组中与保幼激素信号相关的差异表达基因Table 4 Differentially expressed genes related to juvenile hormone signaling in the transcriptomes of diapause eggsand diapause-terminated eggs of Galeruca daurica

2.4 差异表达基因的验证

根据转录组差异表达基因分析结果，随机选取10个差异表达基因(JHE,JHAMT,VgR,HSP68,HK2,JHIP,FAS,CAD,TRE和GHITM)，利用qRT-PCR技术验证其表达模式。结果表明，10个差异表达基因的qRT-PCR与RNA-Seq表达模式相一致(图2)，说明转录组测序数据结果真实可靠，可用于进一步研究。

图2 沙葱萤叶甲滞育卵与解除滞育卵转录组间差异表达基因RNA-seq测序数据的qRT-PCR验证Fig. 2 Verification of RNA-Seq data of differentially expressed genes between the transcriptomes of diapause eggs and diapause-terminated eggs of Galeruca daurica by qRT-PCR

3 讨论

本研究基于Illumina NovaSeq 6000高通量测序平台对沙葱萤叶甲滞育卵和解除滞育卵进行了转录组测序和分析，获得了高质量的转录组数据，为挖掘沙葱萤叶甲卵滞育相关的基因及其信号和代谢通路提供了有力保障。在此基础上，筛选出了大量具有重要生物学意义的差异基因及信号和代谢通路。

核糖体蛋白(ribosomal protein, Rp)是一类参与蛋白质合成、信号传导、细胞代谢、卵子发生等重要生理功能的蛋白质(Goudarzi and Lindström, 2016)。据报道，核糖体蛋白在滞育诱导相关的上游通路中发挥作用(Qietal., 2015)。在本研究中，我们发现RPS3,RPL10A,RPS17,RPS27a和RPS9等40个核糖体蛋白基因在沙葱萤叶甲卵滞育中均显著上调，仅有RPL26下调表达。KEGG富集分析也揭示了大量上调差异表达基因显著富集于核糖体通路(图1: A)。在短光周期诱导的飞蝗滞育卵的转录组中，发现一组核糖体蛋白基因显著上调表达(Jarwaretal., 2019)。Hao等(2017)的转录组和蛋白组研究也表明，大量飞蝗滞育卵与非滞育卵的差异基因和蛋白富集于核糖体通路。因此，核糖体蛋白在昆虫卵滞育中可能起着重要的调控作用。

脂质积累通常发生在滞育前的准备阶段(滞育前期)，为昆虫滞育(启动，维持和终止)提供了重要的能量储备(Liuetal., 2016; Tan QQetal., 2017)。除了在滞育前期积累脂质外，储备足够的脂肪在滞育后期尤其重要，可能会影响滞育终止后昆虫的发育、繁殖和适应性(Hahn and Denlinger, 2011)。沙葱萤叶甲滞育卵中，17个参与脂肪酸生物合成和降解通路的基因差异表达，其中16个上调表达，仅有脂肪酸合成酶基因下调表达(表3)。过氧化物酶具有显著的代谢可塑性，其蛋白质组成和生化功能随生理条件和代谢的需要而变化。在沙葱萤叶甲卵滞育期间，发现2个编码脂肪酰基辅酶A还原酶(fatty acyl-CoA reductase, FAR)的基因表达上调。FAR在长链脂肪醇的形成中起作用(Yangetal., 2012)。脂肪醇是昆虫蜡脂和醚脂的前体，蜡脂在减少水分蒸发和增强对微生物的防御方面发挥作用，而醚脂是重要的膜成分，具有许多不同的作用，包括保护活性氧、介导膜融合和建立细胞的结构渗透屏障等(Cheng and Russell, 2004)。我们推测FAR在滞育卵中的大量表达有助于增强卵滞育期间的抗逆能力，如越冬期间的抗寒能力。酰基辅酶AΔ11去饱和酶[acyl-CoA Delta(11) desaturase, ACD]催化不饱和键引入长链脂肪酸中合成不饱和脂肪酸。我们推测2个编码ACD的基因在沙葱萤叶甲滞育卵中上调表达可导致不饱和脂肪酸增加，以满足滞育期间能量的需求。JH是调节昆虫生长发育的重要内分泌激素。在本研究中，与JH信号相关的7个基因差异表达(表4)，其中，JHE,JHAMT及JHBP在卵滞育期间上调表达。JHAMT是JH合成过程中的关键酶，而JHBP在JH的运输过程中起作用。因此，JHAMT和JHBP在沙葱萤叶甲卵滞育期间上调表达增加了JH滴度，有助于维持卵的滞育状态，而JHAMT和JHBP的下调表达降低了JH滴度，从而诱导了卵滞育的解除。其他研究者也获得了类似的结果(Haoetal., 2017)。

保幼激素诱导蛋白(JHIP)在保幼激素信号传导中的功能研究还未见报道，仅推测可能作为蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)信号通路的媒介分子，介导JH在昆虫中的作用(贺华良等, 2012)。在沙葱萤叶甲卵滞育解除后，JHIP上调表达，可能有利于促进卵的发育。生长激素诱导跨膜蛋白(GHITM)是在进化上高度保守的一类跨膜蛋白, 参与机体生长发育、生长激素诱导、老化及先天免疫系统调节(Yoshidaetal., 2006)。GHITM在沙葱萤叶甲卵滞育解除后上调表达，可能促进了沙葱萤叶甲卵的生长发育、提高了天然免疫防御能力。

细胞信号转导在调节昆虫滞育的发生和维持中起着重要作用。MAPK信号通路广泛存在于生物体细胞内，在昆虫的生长发育及免疫方面至关重要，包括调节细胞分裂、细胞分化、代谢与凋亡和细胞免疫等(Johnson and Lapadat, 2002; Cargnello and Roux, 2011)。Hippo信号通路通过调节细胞的增殖与凋亡控制器官的大小，并且参与表皮发育及组织再生(Pan, 2010; Yu and Guan, 2013)。FOXO信号通路与滞育表型的特征有关，包括生长发育、寿命延长、代谢调控以及应激耐受性等(MacRae, 2010; Melleretal., 2012)。在家蚕胚胎滞育中，发现Hippo信号通路和FOXO信号通路在滞育中发挥重要作用(Chenetal., 2017)。在飞蝗母体对卵滞育影响研究中，发现FOXO信号通路能够刺激母体进而调控下一代卵滞育的发生(Haoetal., 2019)。Hao等(2017)研究表明，昆虫激素合成、胰岛素和PPAR信号通路可能在飞蝗卵滞育调控中起着重要作用。在本研究中，大量下调差异表达基因显著富集于MAPK信号通路、糖胺聚糖生物合成通路和核糖体通路(图1: B)，这些通路可能在沙葱萤叶甲卵滞育中起着重要的调控作用。分析造成差异的原因，可能是因为飞蝗卵滞育为兼性滞育(Haoetal., 2017)，沙葱萤叶甲卵滞育为专性滞育(Zhouetal., 2016)，而不同类型的滞育可能具有不同的调控机制。

本研究通过对沙葱萤叶甲滞育卵与解除滞育卵转录组的比较分析，揭示了与其卵滞育有潜在关联的基因和信号通路，为今后进一步研究主要关联基因及信号通路的功能以阐明沙葱萤叶甲卵滞育机理奠定了必要的基础。