陈红全，王建瑛

1浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科，浙江 杭州 310016；2南京医科大学生殖医学国家重点实验室，江苏 南京 211166

耐药性仍然是治愈癌症的主要限制因素，尽管多种化疗药物早期对肿瘤的治疗效果很好，但随着耐药性的产生，常导致癌症复发［1］，对肿瘤细胞耐药机制的研究有助于更好地治疗癌症。RNA 干扰技术（RNA interference，RNAi）曾被应用于肿瘤细胞耐药基因的筛选，但由于RNAi 不能完全抑制基因表达，而且存在广泛的脱靶效应，影响对基因功能的判定。CRISPR⁃Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9）系统具有高效、便捷等诸多优点，为肿瘤细胞耐药性分子机制的解析提供了强大的工具［2］。

CRISPR⁃Cas 系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的免疫防御系统，用以对抗入侵的病毒及外源核酸［3］。目前，对Ⅱ类CRISPR⁃Cas系统中来源于酿脓链球菌的Streptococcus pyogenesCas9（sp⁃Cas9）研究最为深入，Cas9蛋白作为核酸内切酶，在引导RNA 的指导下识别目标DNA 序列后激活Cas9蛋白的酶切活性［4］。正是由于这种靶向功能，CRIS⁃PR/Cas9 系统已被广泛应用于多物种的基因编辑、基因调控、定位成像、细胞谱系追踪、高通量文库筛选以及病毒检测等领域［5］。目前该系统还存在诸多缺点，如Cas9表达载体过大，不容易被转染进细胞；Cas9载体长时间表达，会增加脱靶的风险［6］。因此，有必要构建一个可诱导表达Cas9的稳定细胞系，用以解决低效转染和因Cas9 长时间表达而导致高脱靶风险的问题。

慢病毒常被用于稳定细胞系的构建，但是需要包装病毒颗粒，费时费力，并存在感染的风险，本研究利用便捷的PiggyBac 转座子系统，成功构建了可诱导表达Cas9 的稳定HeLa 细胞系，并证明在多个位点可以高效切割基因组；……