刘青青

（苏州大学剑桥-苏大基因组资源中心 江苏·苏州 215123）

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

显微镊子、眼用手术剪刀和镊子、26G留置针、70 m滤网、0.45 m过滤器、50mL离心管、10cm细胞培养皿、蠕动泵（LongerPump）、体式解剖镜（Nikon）、显微镜（Olympus）、台式离心机（Thermo）、高压灭菌锅（厦门致微）、细胞培养箱（Thermo）。

1.2 试剂

D-Hank’s平衡盐溶液（PB180321）、DMEM 低糖（PM150246）、DMEM/F12（PM150313）、DMEM 高糖（PM150210）、200mM的Glutamine（PB180419）、1M 的HEPES（PB180325）、PBS、FBS、100×双抗、0.25%Trypsin购自武汉普诺赛生命科技有限公司。DNaseI（KGF008）购自凯基生物。三溴乙醇（T48402）、2-甲基-2-丁醇（240486）、乳酸钠（L4263）、地塞米松（D4902）、CollagenI（C3867）、胶原酶 IV（C5138）、EGTA（E3889）购自 Sigma 公司。无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 溶液配制

（1）麻醉液：称取10g的三溴乙醇，加入10mL的2-甲基-2-丁醇，4℃溶解过夜，使之充分溶解。取出上述溶液1.2mL，加ddH2O定容至100mL，颠倒混匀，4℃避光保存。

（2）100mM EGTA：称取3.804g的EGTA，加入50mL的ddH2O搅拌溶解，搅拌过程中加入2M的NaOH促溶，待 EGTA完全溶解后，调节 pH至7.2后，溶液定容至100mL。高压灭菌后备用。

（3）地塞米松：25mg的地塞米松，加入25mL的无水乙醇，配制成2.55mM（1mg/mL）。取出1mL加入49mL的DMEM高糖培养基，稀释成51 M（20 g/mL）的储存浓度。

（4）Collagen I包被培养板：5mg/mL的Collagen I取出1mL，加入49mL的PBS溶液，将Collagen I稀释为0.1mg/mL。10cm培养皿中加入10mL的0.1mg/mL的Collagen I，室温静置2小时以上或者4℃过夜包被。包被后的培养皿使用前在室温恢复30min，吸弃包被液，用PBS洗涤1次后，可接种细胞。

（5）2%胶原酶IV：称取0.5g的酶，加入25mL的DHank’s平衡盐溶液，搅拌溶解30min，用0.45 m滤器过滤去除不溶颗粒，以免灌流时堵塞血管。

（6）灌流液I：吸取0.5mL1M的HEPES，0.5mL的100mM的EGTA，0.5mL 的100×双抗，用 D-Hank’s补足至 50mL。

（7）灌流液II：吸取0.5mL1M的HEPES，0.5mL的2%胶原酶IV，0.5mL的100×双抗，DMEM低糖补足至50mL。

（8）洗涤液：吸取2.5mL的FBS，10 L的60%w/w乳酸钠，4 L 的 DNase I，0.5mL 的 100×双抗，DMEM/F12补至50mL。

（9）肝细胞培养基：吸取5mL的FBS，0.5mL的100×Glutamine，0.1mL的51 M地塞米松，0.5mL的100×双抗，DMEM高糖补至50mL。

1.4 实验动物

9-12周龄的SPF级C57BL/6J雄鼠购自上海斯莱克实验动物公司，饲养于苏州大学实验动物中心SPF级屏障系统。……