郭延华，皮文辉

(绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆石河子 832000)

0 引 言

1 材料与方法

1.1 材 料

pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(Addgene，42230)，pCAS9-mCherry-Frame+1(Addgene,66940)，pCRISPaint-TagGFP2-PuroR(Addgene，80970)，pMAX(VDC-1040,Lonza)电转仪(Amax NucleofectorⅡ)，流式细胞仪(BDFACSAria Ⅲ)。绵羊原代成纤维细胞采自新疆农垦科学院畜牧兽医研究所种羊场，采集8月龄试验羊只耳缘组织，带回实验室原代培养保存。

QuickExtract DNA 抽提液(QE09050，Epicentre)、PrimerSTAR DNA Polymerase(R045，Takara)、Surveyor 凝胶电泳突变检测试剂盒(706025，Transgenomic)、10× T4ligase buffer(B0202S,NEB)、T4PNK(M0201S,NEB)、2X rapid ligase buffer(B1010,Enzymatics)、T7ligase(L6020L,Enzymatics)和FastDigestBbsI(FD1014,Fermentas)。

细胞培养皿、离心管(Nunc)；DMEM 高糖培养液(61965059，Gibco)；胎牛血清(LOT1407738，BI)；胰酶替代物 TrypLETMExpress(1X)(12604-021，Gibco)。

1.2 方 法

1.2.1 gRNAs(guide RNAs)设计

针对绵羊ACTG1基因TAA终止密码子位点，3’端保留PAM(NGG)。表1

表1 绵羊ACTG1基因羧基端gRNAs序列Table 1 Oligo sequences of C-terminal targets of sheep ACTG1 gene

AGCAGGAGTATGATGAGTCCACCGCAAATGCTTCTAAAGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATGATGAGTCTGGCCCCTCCATTGTCCACCGCAAATGCTTCTAAACGGACTGCGAGCAGACAAATGCTTCTAAACGGACC

1.2.2 gRNA质粒克隆

王积薪手捻一粒黑玉棋子停了下来，一张白玉般的脸变成了酱紫色，半晌抬头对星雨道：“那夜月光入户，照在床枕边，徘徊转移，有一刻就停留在她的脸上。”

磷酸化退火gRNA寡核苷酸，BbsI酶切pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒，用Golden Gate克隆体系，将退火寡核苷酸连接，构建gRNA质粒。首先将合成的正向和反向gRNA寡核苷酸用水稀释至100 μm，分别取1与6.5 μL的水混合，加入10×T4ligase buffer 1 μL和T4PNK 0.5 μL，将10 μL液体混匀，水浴37℃ 30 min。然后将反应管转入PCR仪，95℃ 3 min，直接关闭PCR仪，保持关闭PCR仪顶盖，室温下自动降温退火30 min。将双链退火的反应液补加90 μL水稀释10倍，混匀代用。Golden Gate反应体系是：2×rapid ligase buffer 5 μL、BSA(20 mg/mL)0.3 μL、FastDigest BbsI 0.5 μL、T7 ligase 0.5 μL、退火稀释的gRNA溶液1 μL、pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(25 ng/μL)1 μL和水2.0 μL，混匀。37℃ 水浴60 min。取2～5 μL 连接反应液，直接转染50 μL感受态Stbl3。抗性Amp的LB固体培养基涂板，37℃ 16 h培养。

1.2.3 细胞转染

采用电转染绵羊成纤维细胞。待细胞生长至培养皿的80%，消化收集2×105个细胞，20 μL电转液[7]悬浮，加入相应的质粒，将电击杯放置于电转仪的电击槽中，运行CZ-167电转程序，培养液悬浮细胞后铺于6孔板中培养。

1.2.4 CRISPR-Cas9系统活性检测

检测3个gRNA质粒编辑效率，电转染20 μL，添加gRNA质粒1 μg。……