乌日汉，丽丽，毕力格，陈玉花，肖田梅，孟香花，宝乐尔，朝鲁蒙格日勒，白梅荣*

（1.内蒙古民族大学蒙医药研发工程教育部重点实验室，内蒙古 通辽 028000；2.内蒙古民族大学化学与材料学院，内蒙古 通辽 028000）

蒙药嘎日迪－5，又称五凤丸，由诃子60 g、制草乌30 g、石菖蒲45 g、麝香7.5 g和木香15 g组成［1］。具有杀黏、止痛、燥协日乌素（黄水）、消肿的功效，主治黏刺痛、黏疫、白喉、丹毒、炭疽、赫如虎、吾亚曼、陶赖、协日乌素症、肿胀等证候。是沿用至今的消黏、燥黄水病的含有毒药味草乌的地域性知名复方制剂［2］。临床上由于个体差异或不合理应用含草乌药物可出现神志不清、脉缓、呼吸困难等一系列中毒现象［3］。故嘎日迪－5毒性是使广大医患关注的热点问题之一。目前有关于嘎日迪－5抗炎镇痛的研究报道［4］，但尚未见其嘎日迪－5 相关现代毒理学研究。

宏基因组学规避了不可分离培养的微生物，应用基因组学技术更真实的反应样本中微生物组成、互作情况；直接分析微生物中所含全部基因组信息并在分子水平挖掘其代谢通路、基因功能的一种现代药理和毒理学研究手段［5-6］。从肠道宏基因组学角度切入，对揭示药物多因素、多途径、多基因参与的中毒机制和评价药物安全性均具有非常重要的实际意义。本研究通过宏基因组测序技术分析嘎日迪－5 对肠道菌群的影响，以期探讨嘎日迪－5 亚急性毒性作用和机制，并为其临床安全合理应用提供工作基础。

1 实验材料

1.1 动物

SD雄性大鼠，体质量（200±20）g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供［SCXK（辽）2015－0001］。均饲养在SPF级动物室内，并24 h维持室温为（23±1）℃。

1.2 药品与试剂

嘎日迪－5 由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CKMB）、尿素氮（UREA）、肌酐（CREP）、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒均购自罗氏诊断产品（上海）有限公司。

1.3 仪器

罗氏全自动生化分析仪（cobas c 311，上海罗氏诊断产品有限公司）；核酸电泳仪（DYCP－32C 型琼脂糖水平电泳仪，北京市六一仪器厂）；Covaris超声波破碎仪（Covaris M220，美国Massachusetts）；Qubit Fluorometric Quantification（Qubit 2.0，美国Life Technologies）；安捷伦Agilent 2100 生物分析仪（Agilent 2100，美国Agilent Technologies Co.Ltd）；PCR仪（T100PCR，美国Bio－Rad公司）；测序仪（Novaseq 6000，美国Illumina公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组及取材

SD大鼠32只，按体质量随机分为正常组（Z）、嘎日迪－5高剂量组（GG）0.342 9 g/kg（临床等效量4倍）、中剂量组（GZ）0.085 7 g/kg（临床等效量）、低剂量组（GD）0.021 4 g/kg（临床等效量1/4倍）等，每组8只。从实验第1天开始，各给药组灌胃相应的药物溶液，每日灌胃1次，连续灌胃28 d，正常组灌胃等容量生理盐水。末次给药后，将大鼠肛周消毒后，通过悬尾刺激法无菌采集粪便样品置－80 ℃保存，待测粪便DNA提取及菌群检测。麻醉动物，取血，分离血清，待测心肝肾相关生化指标；采集心、肝、肾肝组织固定于10%甲醛，备用于HE染色。

2.2 CTAB法提取粪便样品DNA

取1 000 μL CTAB 裂解液，加入溶菌酶，将适量的样品加入裂解液中，充分裂解。离心取上清，加酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）混匀，12 000 rpm 离心10 min 取上清，加氯仿∶异戊醇（24∶1），离心取上清加入异丙醇，－20 ℃沉淀。离心倒出液体，用1 mL 75%乙醇洗涤2 次，晾干，加ddH2O 溶解DNA 样品，加RNase A 1 μL消化RNA，37 ℃放15 min即可。

2.3 宏基因组建库测序

2.3.1 样品检测

用琼脂糖凝胶电泳对DNA 样品的纯度和完整性进行检测。

2.3.2 文库构建及库检

将检测合格DNA样品进行打断，再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库构建。使用Qubit 2.0 进行初步定量，随后用Agilent 2100 对文库的插入片段进行检测，插入片段符合预期后，通过Q－PCR方法对文库的有效浓度进行定量。

2.3.3 上机测序

文库检测合格后，将不同文库pooling至flowcell，cBOT成簇后使用Illumina PE150高通量测序平台进行测序。

2.4 数据处理

采用Knead Data 对原始数据进行质控和去宿主。通过Kraken2 和微生物数据库来鉴别样本所含物种，再用Bracken 对样本中物种的实际相对丰度进行注释。运用MEGAHIT 软件，将去宿主基因后的clean reads 进行组装，得到contigs 预测其基因序列，用Cdhit 对得到的基因进行去冗余和定量，使用DIAMOND软件，注释去冗余基因相对丰度。

基于物种丰度表和功能丰度表，进行PCoA（主坐标分析）分析来评估物种组成差异。用LEfSe（多级物种差异判别分析）和LDA（线性判别分析）鉴定组间差异物种和功能。使用spearman correlation 分析物种与血清因子、病理指标的相关性。

应用SPSS 22.0 进行统计分析。采用t检验、秩和检验、单因素方差分析分别进行组间比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 嘎日迪－5血液生化指标检测结果

与正常组比较，嘎日迪－5 高剂量组ALT、UREA、CK、CKMB 含量显著升高（P＜0.05），嘎日迪－5 中、低剂量组UREA、CREP、CKMB、ALP 含量显著下降（P＜0.05），低剂量组AST含量显著下降（P＜0.05）。提示，嘎日迪－5对心、肝、肾脏具有一定的毒性。结果见表1。

表1 嘎日迪-5对大鼠生化指标的影响（±s，n=8）

表1 嘎日迪-5对大鼠生化指标的影响（±s，n=8）

注：与正常组（Z组）比较，**P ＜0.01，*P ＜0.05。

ALP（U/L）118.00±26.24 113.14±15.20 77.71±28.61*86.42±32.25*组别Z组GG组GZ组GD组ALT（U/L）34.15±5.04 48.71±14.72*36.34±11.35 31.38±7.13 AST（U/L）63.08±12.85 69.97±22.97 56.92±18.69 51.78±16.84*UREA（mmoL/L）4.22±0.46 5.35±1.23*3.36±0.53**3.18±0.71**CREP（μmol/L）79.83±15.11 83.71±12.86 62.85±8.51*57.33±13.70*CK（U/L）133.40±19.42 226.83±60.36*127.00±64.26 127.83±81.58 CKMB（U/L）263.24±15.19 335.83±63.99*180.93±46.79*194.01±64.24*

3.2 病理检测结果

3.2.1 肝组织病理检测

正常组肝小叶结构清晰，肝细胞索和肝血窦大致呈放射状排列，肝细胞圆润、饱满，肝板排列规则、整齐。嘎日迪－5高剂量组肝细胞广泛水肿；中剂量组个别肝细胞水肿、胞质疏松淡染；低剂量组未见明显异常。见图1。

图1 肝组织病理切片图（HE染色，×400）

3.2.2 心脏组织病理检测

正常组心肌纤维排列整齐规则，胞核呈蓝色，胞质呈淡粉色，细胞结构清晰。嘎日迪－5高、中剂量组心肌纤维排列紊乱，胞质疏松淡染，部分细胞水肿。低剂量组心肌纤维排列略紊乱，胞质疏松淡染。见图2。

图2 心组织病理切片图（HE染色，×400）

3.2.3 肾组织病理检测

正常组肾小球毛细血管较清晰，肾小管排列紧密，上皮细胞形态正常。嘎日迪－5 高剂量组肾小管上皮细胞有明显水肿、部分呈空泡化现象；中、低剂量组肾小管上皮细胞略有水肿。见图3。

图3 肾组织病理切片图（HE染色，×400）

3.3 肠道菌群测序结果

3.3.1 菌群丰度分析

在门、种水平菌群组成注释结果显示（图4、图5）：在门水平，GG 组厚壁菌门（Firmicutes）拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）丰度显著增加，疣微菌门（Verrucomicrobia）、变形菌门（Proteobacteria）丰度下降。

图4 在门、属水平菌群柱形图

图5 门、属水平菌群热图

在种水平，GG组鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）、嗜黏蛋白艾克曼菌（Akkermansia muciniphila）、约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）、大肠杆菌（Escherichia coli）丰度下降，罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）丰度增加。说明GG明显改变大鼠肠道菌群结构。

3.3.2 组间差异物种分析

为鉴定两组间显著差异物种，使用LEfSe 及LDA（LDA score ＞2 阈值）分析结果如图6所示：每横向柱形代表一个物种，柱形的颜色对应该物种的分组，柱形长度对应LDA 值。Z 组和GG 组间菌群丰度存在明显的差异。

图6 LEfSe分析LDA柱形图

与Z 组相比，假长双歧杆菌（Bifidobacterium pseudolongum）、动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）、Alistipes timonensis、Alistipes finegoldii、北拟杆菌（Bacteroides nordii）、多枝梭菌（Erysipelatoclostridium ramosum） 、Desulfovibrio fairfieldensis、隐 藏 梭 菌（Clostridium celatum）、大肠杆菌病毒Rtp（Escherichia virus Rtp）、达卡雷梭菌（Clostridium dakarense）、Olsenella uli、脱硫弧菌G11（Desulfovibrio sp G11）、尸毒梭菌（Clostridium cadaveris）等35个菌种明显在GG组中富集。

为两组间物种组成的相似性及差异情况，进一步经PCoA 分析结果所示（见图7）：GG组与Z组间样本未重叠，表示两组间菌群结构存在一定差异。

图7 基于Bray Curtis距离矩阵的PCoA 图

3.4 菌群相关性分析

使用Spearman 相关分析，探讨了草乌亚急性毒性与差异菌种的关联。结果见图8，其中颜色深浅代表相关系数，横坐标为血清因子，纵坐标为物种。

图8 相关性热图

血清UREA 与相对丰度升高的生孢梭菌（Clostridium sporogenes）、Alistipes indistinctus、无害梭菌、隐藏梭菌、Alistipes ihumii、Alistipes finegoldii、Alistipes obesi 显著正相关，与相对丰度降低的啮齿类幽门螺杆菌（Helicobacter rodentium）负相关。

血清CK、CKMB、ALT、AST与相对丰度升高的豚双歧杆菌（Bifidobacterium choerinum）显著正相关，与相对丰度降低的停滞棒杆菌（Corynebacterium stationis）、马里斯棒状杆菌（Corynebacterium maris）、解脲寡源杆菌（Oligella ureolytica）、Butyricimonas synergistica显著负相关。

血清CK、CKMB、ALT 也与相对丰度升高的Desulfovibrio fairfieldensis、假长双歧杆菌、Faecalibaculum rodentium、粪异杆菌显著正相关，与相对丰度降低的大肠杆菌负相关。

血清CREP 与相对丰度降低的［Clostridium］glycyrrhizinilyticum 显著负相关。

血清ALP 与相对丰度降低的生孢梭菌、Alistipes indistinctus 显著负相关。说明，这些菌种主要参与心肝肾血清因子的调控。

3.5 KEGG功能注释

基于KEGG数据库、LEfSe及LDA（LDA score ＞2）方法进行代谢通路分析，结果见图9所示：每横向柱形代表一个通路，柱形的颜色对应相应分组的特征代谢通路ID，柱形的长度对应LDA值。两组间共鉴定出12个丰度相对较高的代谢通路。GG组显著富集在蛋白质输出（map03060）、肽聚糖生物合成（map00550）、牛磺酸和低牛磺酸代谢（map00430）、金黄色葡萄球菌感染（map05150）、群体感应（map02024）、ABC转运蛋白（map02010）等通路。

图9 KEGG代谢通路LEfSe分析LDA柱形图

通过KO（KEGG Orthologous groups）LEfSe 组间差异比较结果显示，草乌组在蛋白质输出通路中显著富集，说明注释到的功能基因在这通路中占据优势。如图10 和图11所示：蛋白质输出通路中GG 组yidC、SRP54 特征基因大部分来自约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、脆乳杆菌、动物双歧杆菌、产液阿德勒克罗伊茨菌、其他、未分类菌。其中，yidC 也来源于大肠杆菌、massiliensis 拟杆菌（Bacteroides massiliensis）；SRP54也来源于假长双歧杆菌、阴道乳杆菌（Lactobacillus vaginalis）。

图10 蛋白质输出通路

图11 特征基因分层柱状图

4 讨论

4.1 血清生化和病理组织学层面对嘎日迪－5 毒性的评价

血清ALT、AST 能灵敏的评估肝细胞的功能状况。本试验中，GG 组ALT 与正常组比明显升高，伴随肝细胞广泛水肿；GZ、GD 组ALP 显著下降（P＜0.05）；GD组AST 显著下降（P＜0.05）。说明嘎日迪－5 导致大鼠肝细胞损伤和功能障碍。血清UREA、CREP 是反映肾功能变化的常用指标。本试验中，GG 组UREA 含量增高，肾小管上皮细胞明显水肿；GZ、GD 组UREA、CREP 显著下降（P＜0.05）。提示嘎日迪－5引起对大鼠肾小球滤过率功能产生损害。血清CK、CKMB 是心肌受损程度的主要指标。本研究发现，GG 组CK、CKMB 显著升高，心肌纤维排列紊乱、部分细胞水肿、胞质淡染疏松；GZ、GD 组CKMB 显著下降（P＜0.05）。表明嘎日迪－5 对大鼠心肌细胞产生损害。即嘎日迪－5对心、肝、肾脏具有不同程度的毒性。

4.2 差异菌种层面对嘎日迪－5毒性的评价

阿利斯佩斯菌属包括Alistipes finegoldii、Alistipes ihumii、Alistipes timonensis 等13 种亚型，与肠道炎症、肝炎、肝性脑病等息息相关［7-9］。多枝梭菌过量增加有助于代谢综合征和肥胖的发展。大肠杆菌病毒Rtp、达卡雷梭菌、Olsenella uli 与炎症密切相关［10-11］。尸毒梭菌的显著富集可增加对肠道、肝脏、肾脏的嗜性，具有严重的致病性，也会引起部分感染、脓肿、菌血症等［12］。Desulfovibrio fairfieldensis 是脱硫弧菌属一种常见致病性菌，脱硫弧菌在肠道中显著富集可促进非酒精性肝病、肝纤维化的发生和发展［13-14］。本研究经LEfSe 组间分析结果显示，GG 组中Alistipes timonensis、Alistipes finegoldii、多枝梭菌、Desulfovibrio fairfieldensis、Alistipes ihumii、隐藏梭菌、大肠杆菌病毒Rtp、达卡雷梭菌、Olsenella uli、脱硫弧菌G11、尸毒梭菌等显著富集。提示，阿利斯佩斯菌属、尸毒梭菌、Desulfovibrio fairfieldensis 的显著富集可能与嘎日迪－5引发肝肾毒性有关。肠道菌群紊乱能加剧炎症反应，并减弱肠道屏障，促进毒素从肠道位移入血液循环到达肝脏，从而扰乱肝脏代谢和分泌功能［15］。可见，嘎日迪－5 中大肠杆菌病毒Rtp、达卡雷梭菌、Olsenella uli菌的增加可能有助于肝功能的损害。

相关性分析显示，血清UREA与Alistipes indistinctus、Alistipes ihumii、Alistipes finegoldii、Alistipes obesi显著正相关。推测嘎日迪－5 肾毒性表达可能与Alistipes 菌属的增加有关。血清CK、CKMB、ALT与相对丰度升高的Desulfovibrio fairfieldensis 显著正相关。由此推断，Desulfovibrio fairfieldensis 的富集可能是嘎日迪－5 产生心脏毒性和肝功能紊乱的主要机制之一。

4.3 蛋白质输出通路层面对嘎日迪－5毒性的评价

yidC属于Oxal/Alb3/YidC蛋白家族，细菌中的yidC能辅助其他膜蛋白催化插入到细胞膜，并负责参与大部分SecYEG转运蛋白在膜上正确地插入及组装。因此在能量代谢中至关重要。当细菌暴露于细胞表面后，yidC蛋白水平升高，而相应的mRNA水平显著降低。在药物诱导下，会导致yidC蛋白的显著诱导［16－17］。yidC、secD、secA和yajC基因的表达能敏感的通过不同环境因素来影响细菌的黏附［18］，从而可能促进毒力因子的产生，致使细胞膜发生病理性变化。本实验结果表明，蛋白质输出通路中yidC、secD、secA 和yajC 在GG 组中有表达，其中yidC 是GG组特征基因。SRP54是信号识别蛋白（SRP）的重要组分，是核糖核蛋白复合物的保守成分，能介导蛋白质的共翻译、靶向和易位至内质网，对各组织的发育非常重要。研究报道，SRP54过表达能增加病毒的复制［19］。SRP54的突变负面影响整个SRP介导的蛋白质分泌途径，从而导致严重的中性粒细胞减少症，伴胰腺功能不全及骨骼疾病等［20］。在肿瘤相关通路中SRP54 基因的表达具有活性，有望作为膀胱尿路上皮癌（BLCA）的生物标志物［21］。本实验结果表明，蛋白质输出通路中SRP54是GG组特征基因。可见，蛋白质输出通路中高丰度的yidC、secD、secA和SRP54的表达与嘎日迪－5亚急性毒性有关。

综上，嘎日迪－5以临床等效量4倍量连续灌胃28 d有一定的心肝肾毒性，即具有一定亚急性毒性；初步认为肠道中阿利斯佩斯菌属、Desulfovibrio fairfieldensis的显著富集是嘎日迪－5产生心脏毒性和肝肾功能紊乱的主要机制之一；其亚急性毒性与蛋白质输出通路相关。该研究为进一步采用敲除yidC、secD、secA和SRP54基因法验证其嘎日迪－5肝肾心毒性研究奠定了工作基础。