李婷婷，王丹丹，卢晓琦，吴发明，姚秋阳

(遵义医科大学 药学院，贵州 遵义 563000)

硒(Selenium,Se)是人体所必需的微量元素之一.适量硒的摄入对维护身体健康具有重要作用[1],它可以增强免疫力、延缓衰老、预防癌症、促进生长发育和预防心血管[2-3].世界卫生组织建议正常成年人每天硒的摄入量为50～400 μg(中国卫生行业标准WS/T 578.3-2017).有研究显示：人体缺硒会导致一些慢性疾病如克山病、大骨节病等[4]，而过量摄入也会导致神经系统慢性疾病、慢性脱发、皮肤损伤等，严重者还可能导致直接死亡，可见，适当摄入硒元素至关重要[3-4].因此测定食品或药材中的硒元素对食品和药品的安全和质量评价非常重要.

硒含量的测定方法包括氢化物-原子荧光光谱法(AFS)、原子吸收光谱法(AAS)、紫外可见分光光度法(UV-Vis)、高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱法(HPLC-HG-AFS)以及电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)[5-8].原子吸收光谱法有严重的基体干扰和灵敏度低等缺点；而荧光法虽然准确但操作繁琐，这两种方法均有不足之处.氢化物原子荧光光谱法具有简便、快速、准确度、精密度好，线性范围宽，所用试剂毒性小，实用性强的优点[9-10].现行的食品安全国家标准食品中硒的测定(GB5009.93—2017)中氢化物原子荧光光谱法是检测食品中硒元素的首选方法.其基本原理是：样品经消化后，在6 mol·L-1盐酸介质中，将试样中的Se6+还原成Se4+，在硼氢化钠或硼氢化钾的作用下将四价硒在盐酸介质中还原成硒化氢[11]，硒化氢原子化后可在硒空心阴极灯照射下，在去活化回到基态时，发射出特征波长的荧光，能与标准系列比较定量.

快速、简便、准确测定硒含量是研究富硒中药材的关键技术基础，本实验旨在利用氢化物-原子荧光光谱法准确测定党参的硒含量，以为富硒党参的质量评价奠定方法学基础.

1 材料与仪器

1.1 实验药材

供试11批党参药材来自四川成都荷花池药材市场，由遵义医科大学药学院吴发明副教授鉴定为党参.

1.2 试剂

硒酸钠(成都艾科达化学试剂有限公司)；硼氢化钠(上海泰坦科技股份有限公司)；盐酸分析纯(重庆川东化工有限公司)；硝酸分析纯(成都市科龙化工试剂厂)；高氯酸分析纯(成都市科龙化工试剂厂)；硫酸分析纯(成都市科龙化工试剂厂)；硒标准溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心).

1.3 仪器

BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；PHS-25型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；101-4A电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(常州普天仪器制造有限公司)；AFS-8800双道原子荧光光度计(北京海光仪器公司)；超纯水机(德国默克密理博有限公司).

2 方 法

2.1 样品及标准溶液的制备

2.1.1 标准品溶液的制备

1 mg·L-1的硒标准溶液：精密量取1 mL硒标准溶液(1 000 μg·mL-1)用蒸馏水定容至1 000 mL.

还原剂硼氢化钠碱溶液(8 g·L-1)：称取5 g氢氧化钠于100 mL干净的小烧杯内，加入50 mL超纯水，溶解，再加入8 g硼氢化钠，溶解完成后，将溶液转移至1 000 mL容量瓶中，充分摇匀，用蒸馏水定容.

载流液盐酸溶液(5+95)：量取25 mL盐酸，缓慢加入475 mL水中，混匀.

2.1.2 样品前处理

第2 d在加热板上加热(140～180 ℃，低于200 ℃)，并根据需要及时添加硝酸.当溶液为澄清无色并伴有白色烟雾时，开始赶酸(220～250 ℃)至剩余体积为1～2 mL，不可蒸干.冷却后加入6 mol·L-1的盐酸溶液5 mL，并继续加热直至溶液澄清无色，并伴有大量白烟(160 ℃，15 min).冷却后转移至容量瓶中，加入2.0 mL浓盐酸，用蒸馏水定容，同时做试剂空白试验，所有试样均4 ℃保存备查.移取10.0 mL试样消化液于15 mL离心管中，加入浓盐酸2.0 mL，铁氰化钾溶液1.0 mL，混匀后放置2 h待测.采用原子荧光光谱法测定硒含量，每个处理组测量3次取平均值.

2.2 仪器条件

采用原子荧光光谱法测定党参中硒元素含量的定量分析方法，主要参数如下：负高压270 V；灯电流70 Ma；原子化温度800 ℃；炉高8 mm；载气流速500 mL·min-1；读数方式：峰面积；读数时间15 s；加液时间8 s；进样体积2 mL；测量方式：标准曲线法.

2.3 标准工作曲线的绘制

精密量取“2.1.1”项下制备的硒标准溶液0、0.50、1.00、2.00和4.00 mL于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度.该硒标准溶液的质量浓度分别为0、5.00、10.00、20.00和40.00 μg·L-1.以上标准溶液均置于4 ℃冰箱内避光保存.

2.4 方法学考察

2.4.1 线性考察

将仪器参数调至最佳工作状态，分别对0、5、10、20、40 μg·L-1硒标准溶液进行测量，每个浓度3次重复，记录荧光强度测量值，取算术平均值后，按线性回归法求出工作曲线的线性相关系数R2.

2.4.2 检出限

将仪器参数调至最佳工作状态，用硼氢化钠作为还原剂分别对0、5、10、20、40 μg·L-1硒标准溶液进行3次重复测量，记录荧光强度测量值，取算术平均值后，按线性回归法求出斜率k.将“2.3”项下制备的0 μg·L-1的硒标准溶液连续进行11次硒含量测量，记录其荧光强度，求出其相对标准偏差S0，按下式计算出检出限Q.按照2009版《中华人民共和国国家计量检定规程》，Q≤0.4 ng·mL-1.

Q=3S0/k.

(1)

2.4.3 加样回收实验

分别精密称取9份0.5 g党参样品，按“2.1.2”项下操作进行消化，同时制备空白对照，后向样品消化液中加入适量硒标准溶液，配制成含硒加入浓度分别为低、中、高3个质量浓度的对照品溶液(分别相当于原待测样品中质量分数的80%、100%、120%).每个浓度平行配制3份，记录硒荧光强度值(A)，计算硒荧光强度值(ΔA=A-A0)，根据下列公式计算回收率.

回收率(%)=(测定总量-硒含量)/加入量*100 .

(2)

2.4.4 精密度试验和准确度试验

精密度试验中取10 μg·L-1标准溶液1 d内连续进样7次，在拟定的条件下进行硒含量测定，记录硒浓度值，计算其相对标准偏差(RSD)值.准确度试验中对同一份党参样品进行硒含量测定6次.计算其硒含量平均值，计算相对标准偏差(RSD)值.

RSD(%)=标准偏差(SD)/平均值*100 .

(3)

(4)

2.4.5 稳定性试验

配制党参样品和空白组织样品置于锥形瓶中，后按“2.1.2”项下操作处理进行原子荧光分析，分别在0、20、40、60、80、100 min按上述仪器条件进行含量测定，记录荧光强度值.

2.5 数据处理

数据结果采用SPSS进行单因素方差(One-way ANOVA)及LSD和Dunnett检验进行多重比较分析(P<0.05)，所得统计结果使用Graphpad prism进行图形绘制.

3 结果与讨论

3.1 方法学考察

3.1.1 线性关系考察与检出限

线性考察结果如图1所示.

浓度/(μg·L-1)图1 硒标准曲线

硒含量在0～40 μg·L-1质量范围内与其荧光强度线性关系良好，回归方程为y=57.371x+18.201(R2=0.999 9).检出限为Q=0.065 ng·mL-1，符合JJJ 939—2009《中华人民共和国国家计量检定规程》要求(≤0.4 ng·mL-1).

3.1.2 加样回收实验

对照品溶液的加样回收率平均值为113.33%，相对标准偏差(RSD)为4.97%，说明方法具有较好的精密度.符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》附录F检测方法确认的技术要求(60%～120%).结果见表1.

表1 加样回收实验结果

3.1.3 精密度试验和准确度试验

选用10.0 μg·L-1系标准溶液进行精密度测量，精密度RSD为1.65%.使用标准样品进行准确度试验6次，准确度RSD为4.58%.符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》附录F检测方法确认的技术要求(-20%～10%)，结果见表2.

表2 精密度试验和准确度结果

3.1.4 稳定性试验

常温下党参样品在0～100 min的稳定性RSD为6.52%，结果见表3.

表3 稳定性试验结果

3.2 不同品种党参的硒含量比较

采用同一地区的11个不同品种党参探究对硒含量的影响，结果显示不同品种之间的硒含量稍有不同但都在0.1 mg·kg-1以下(见图2).

党参品种图2 不同品种党参硒含量

4 结 论

建立一种简便、快速、准确度、精密度好，线性范围广，所用试剂毒性较小，灵敏度高，重复性高，实用性强的原子荧光光谱法，方法检出限低为0.065 ng·mL-1，标准曲线线性良好.硒含量在0～40 μg·L-1质量范围内与其荧光强度呈现良好的线性关系(R=0.999 9)；检出限为Q=0.065 ng·mL-1；加样回收率为113.33%，RSD为4.97%；精密度RSD为1.65%；准确度RSD为4.58%；稳定性RSD为6.52%；11个不同品种党参之间的硒含量稍有不同但都在0.1 mg·kg-1以下.适用于测定党参中的硒含量，为富硒党参的质量评价提供方法基础.