杜天北，权茹君，聂承冬，邓 斌，温 静(哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)

结肠炎是直肠、结肠黏膜的非特异性炎症病变，多因自身免疫反应、感染、遗传、精神等因素而引发.其主要症状是腹泻、腹痛、黏液便和脓血便，严重者甚至大便秘结，并且伴有虚弱、乏力等症状，容易反复.槐花丸是一味治风剂，具有凉血止血之效，主治肠风下血，与现代病症结肠炎症状相符[1]，选自宋代医方《鸡峰普济方》卷十.方剂由槐花一两、蒲黄半两、地榆半两、卷柏半两和干姜一分组成，用法是每服一钱，水一盏，煎数沸，不拘时候服.《滇南本草》中记载槐花“味苦、涩，性寒，功多大肠经”，槐花能够凉血清肝、止血泻火，具有一定的抗炎作用[2]；《本草汇言》中记载“蒲黄，性凉而利，能洁膀胱之原，清小肠之气，故小便不通，前人所必用也”，王自梁等[3]发现了蒲黄具有抗炎活性；根据《中药大辞典》记载，地榆具有“凉血止血、清热解毒”的功效，并且近些年有相关研究[4]发现地榆具有一定的抗炎作用；《本草求真》中记载“卷柏，其治有分生熟.生则微寒，力能破血通经，故治症瘕淋结等症”，Sunmin等[5]发现卷柏中的部分炔酚类成分具有良好的抗炎活性；《唐本草》记载干姜“治风，下气，止血，宣诸络脉，微汗”，陈琛等[6]用代谢组学的方法探索了干姜对溃疡性结肠炎的作用.综上，槐花丸是治疗结肠炎的经典方剂，但对其方剂的主要作用成分和靶点以及结肠炎疾病基因之间的关系探索仍然比较匮乏.

网络药理学能够方便的筛选有效成分，预测药物和疾病的靶点，并对相关信号通路进行探索，反映药物的作用机制和信号通路，为提高药物的治疗效果和提高药物开发与试验的效率打下基础.中药复方的作用机制比较复杂，传统研究方法进展较为缓慢，网络药理学作为一门新兴学科，其研究方法具有整体、系统、动态等诸多优点，能够很好的满足中医药与现代药理学靠近的需求[7]，为中医药现代化发展提供了新的研究方向.

本研究基于网络药理学对槐花丸治疗结肠炎的主要成分、作用靶点及信号通路等方面做了相关检索与分析，目的是对槐花丸治疗结肠炎的作用机制进行探索，为其他学者研究槐花丸及其临床应用提供依据.

1 材料与方法

1.1 数据库及软件

本研究涉及到的数据库有TCMSP(https://tcmspw.com/tcmspsearch.php)，ETCM(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php)，PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)，Uniprot(https://www.uniprot.org)，OMIM Entry Search(https://omim.org/)，GeneCards(https://www.genecards.org/)，TTD Database(https://bigd.big.ac.cn/databasecommons/)，MalaCard(https://www.malacards.org/)，Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，STRING (https://string-db.org/)，DAVID Bioinformatics Resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)，KEGG Mapper(https://www.genome.jp/kegg/mapper.html)；软件有ChemOffice2018, Cytoscape 3.7.2

1.2 槐花丸主要成分的筛选

应用Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology(TCMSP)和The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine(ETCM)数据库，分别找到槐花、蒲黄、地榆、卷柏和干姜含有的化合物，并以OB(口服生物利用度)≥30%和DL(药物相似性)≥0.18 作为条件，在数据库中筛选出主要成分，并对组成槐花丸的药物的主要成分进行补充，最终确认槐花丸的主要成分.

1.3 槐花丸主要成分抗炎靶点的筛选

利用TCMSP，ETCM和PubChem数据库分别获取槐花、蒲黄、地榆、卷柏、干姜中主要成分的作用靶点，然后用Swiss Target Prediction对作用靶点进行预测补充，其中species选择Homo sapiens(智人)，其余参数设置为默认进行靶点预测.将所有主要成分进行预测、筛选和去重之后，使用Uniport数据库对得到的信息进行矫正，选择“Homo sapiens”为条件筛选出人类靶点，最终作为槐花丸主要成分的预测靶点.本研究主要探索槐花丸对结肠炎的作用，故以“colitis”为关键词，在OMIM Entry Search、GeneCards、TTD Database、MalaCards数据库中收集结肠炎相关基因，使用Venny 2.1平台将检索到的结肠炎相关基因与槐花丸主要成分预测靶点对应的基因进行映射，绘制韦恩图，筛选出共同基因，进而确认槐花丸治疗结肠炎的作用靶点.

1.4 槐花丸治疗结肠炎的作用成分-作用靶点网络的构建

将确定的槐花丸治疗结肠炎的作用靶点与槐花丸主要成分作用靶点取交集，对应出槐花丸治疗结肠炎的有效成分，使用Cytoscape (3.7.2) 软件，导入槐花丸治疗结肠炎的作用成分和治疗结肠炎的作用靶点的数据和属性表格，构建“成分-靶点”相互作用网络图，网络图中的node(节点)分别表示作用成分和作用靶点.作用成分与作用靶点之间的相互关系以edge(边)表示.基于网络拓朴学的原理，选择Free Degree(网络节点拓扑结构特征值 “自由度”)与最大自由度，筛选出核心网络，进而筛选出槐花丸治疗结肠炎的活性成分.

1.5 蛋白相互作用(PPI)网络的构建与分析

将筛选得到的槐花丸治疗结肠炎的作用靶点对应的基因导入String平台，选择种属为Homo sapiens，设置最低相互作用阈值为最高“Highest confidence”>0.9，其他参数不变，获得槐花丸治疗结肠炎的蛋白与蛋白相互关系网络(protein-protein interaction，PPI)，下载为.tsv格式，导入Cytoscape3.7.2筛选数据，并按照“Degree”的大小进行排序分类.

1.6 核心靶点富集分析与可视化(GO and KEGG分析)

使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8平台对槐花丸治疗结肠炎的作用靶点进行Gene ontology (GO)和信号通路(KEGG)的富集分析，之后通过Omicshare平台绘制柱形图和高级气泡图对通路进行可视化分析.使用KEGG Mapper做出信号通路(KEGG)热图.

2 实验结果

2.1 槐花丸主要成分的筛选

使用TCMSP数据库，以OB(口服生物利用度)≥30%和DL(药物相似性)≥0.18 作为条件，在数据库中筛选出槐花、蒲黄、地榆、卷柏和干姜的主要成分，再使用ETCM数据库对组成槐花丸的药物的主要成分进行补充，最终经过筛选去重共得到57个主要成分.

2.2 槐花丸主要成分抗炎靶点的筛选

通过TCMSP，ETCM和PubChem数据库和Swiss Target Prediction对槐花丸57个主要成分的作用靶点进行预测，将所有主要成分进行预测、筛选和去重之后，共得到619个基因靶点.在OMIM Entry Search、GeneCards、TTD Database、MalaCards数据库中收集结肠炎相关基因，去重后共得到659个疾病靶点基因，将结肠炎相关基因与槐花丸靶点基因进行映射，绘制韦恩图，见图1，得到共同靶点110个，确定为槐花丸治疗结肠炎的靶点基因,部分靶点信息见表1.

图1 成分靶点-疾病靶点映射韦恩图

Table 1 Common targets of drug component-disease

2.3 槐花丸治疗结肠炎的作用成分-作用靶点网络的构建

以110个结肠炎靶点基因作为槐花丸治疗结肠炎的作用靶点，对应出槐花丸治疗结肠炎的作用成分54个.建立槐花丸作用成分-靶点网络，见图2.共有164个节点，26732条边，其中54个绿色节点代表槐花丸治疗结肠炎的有效成分，110个黄色节点代表结肠炎疾病靶点，26732条边代表槐花丸治疗结肠炎的作用成分与作用靶点的相互作用.根据网络拓朴学结构数据得到化合物的中位度数为9，筛选出度值(Degree)> 9的26个化合物，这些化合物是槐花丸治疗结肠炎的活性成分.见表2.

图2 槐花丸治疗结肠炎作用成分-靶点网络

图3 槐花丸治疗结肠炎的PPI网络

2.4 蛋白相互作用(PPI)网络的构建与分析

槐花丸治疗结肠炎的蛋白-蛋白相互作用网络(protein-protein interaction，PPI)见图3，将数据下载为.tsv格式，导入Cytoscape3.7.2筛选，按照“Degree”的大小进行排序分类，条件设置为Degree >8，共筛选出46个靶点，部分核心靶点及拓扑参数见表3，这些蛋白作用较强，在该网络中发挥关键作用.

表2 槐花丸治疗结肠炎的活性成分

表3 核心靶点及拓扑参数

2.5 核心靶点富集分析与可视化(GO and KEGG分析)

使用DAVID数据库对槐花丸治疗结肠炎的核心靶点进行GO分析和KEGG分析，根据FDR<0.05，筛选出BP Bioprogress(细胞生物过程.如：粘附、迁移、凋亡、周期等)310个，CC cell components(细胞组成.如：细胞膜、细胞质等)27个，MF Molicular Function(分子功能)73个，Pathway 91条，根据Count进行排序，每种取前10个，见图4，分析结果中细胞生物过程富集的基因数最多，FDR值较低，说明槐花丸主要通过调节细胞生物过程(如：粘附、迁移、凋亡、周期等)治疗结肠炎.对91条Pathway进行KEGG分析，其中包括Hepatitis B、TNF signaling pathway、Rheumatoid arthritis和Inflammatory mediator regulation of TRP channels等多条抗炎通路，根据靶标命中数量排序对91条通路进行分析，做可视化处理，得到图5.

图4 槐花丸的GO分析

图5 槐花丸的KEGG分析

2.6 通路分析

根据KEGG通路分析，91条通路均与结肠炎有关，Hepatitis B通路共有12个靶基因；TNF signaling pathway通 路 共 有 11个靶 基 因；Rheumatoid arthritis通 路共有5个靶 基 因、Inflammatory mediator regulation of TRP channels通 路共有5个靶 基 因等.从数据可以看出槐花丸可能还对Proteoglycans in cancer、Prolactin signaling pathway、Toxoplasmosis等有作用，见图6，通路-靶点相互作用网络.槐花丸和Hepatitis B信号通路的靶点表示图，见图7.

图6 槐花丸通路-靶点相互作用网络

图7 槐花丸和Hepatitis B信号通路的相关靶点表示图

3 讨 论

本研究通过网络药理学的方法研究槐花丸治疗结肠炎的作用机制.通过以上技术得到槐花丸的54个主要成分，运用网络拓朴学的方法，筛选出26个(Apigenin、Isocryptomerin、Arachidonic acid、Kaempferol、Sexangularetin、Isorhamnetin、Quercetin等)抗炎活性较好的活性成分，其可能作用于STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、TNF和VEGFA等关键靶点，并参与91条信号通路；其中Hepatitis B信号通路与槐花丸治疗结肠炎作用有密切联系.

本研究筛选出来的活性成分中，芹菜素(Apigenin)、异柳杉素(Isocryptomerin)、山奈酚(Kaempferol)等黄酮类化合物已经被相关文献证实具有抗炎活性，其中，刘琴等[8]通过分析促炎细胞因子(iNOS、COX-2和AP-1)的表达，确定芹菜素(Apigenin)能显著抑制促炎细胞因子和AP-1蛋白的表达，包括一氧化氮的产生，证实了芹菜素的抗炎作用；张雅雯等[9]发现山奈酚(Kaempferol)具有抗炎作用.李林蔓等[10]发现槲皮素(Quercetin)可通过提高Treg细胞分化、降低Th17细胞分化进而恢复Th17/Treg平衡以及提高HO-1的表达水平和活性，从而改善急性喉炎模型大鼠喉部组织的炎性.柳泽深等[11]发现花生四烯酸(Arachidonic acid)可通过影响膜受体活性调节基因表达；Li等[12]发现Isorhamnetin可抑制OGD与MGO对于人脑微血管内皮细胞的毒性作用，该保护作用与其抗炎、抗氧化应激、抗凋亡机制有关.郭丽等[13]发现银杏双黄酮(Ginkgetin)对高糖刺激HMEC炎症反应有明显的干预作用,其机制可能与抑制NF-kB信号通路活化,从而降低炎症反应水平有关；Liu等[14]发现银杏双黄酮(Ginkgetin)可减轻炎症，氧化应激和细胞凋亡；曹园等[15]发现Tamariscina ester显示出对氟康唑、酮康唑的抗念珠菌活性的体外增效作用.Tanaka等[16]发现3-O-galloylprocyanidin B-3具有止血作用[17-20].

综上所述，槐花丸中含有的黄酮类成分可能是其治疗结肠炎的主要有效成分，分别与STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、TNF、VEGFA等靶点相关联起到治疗作用，本研究通过网络药理学和网络拓朴学的方法，总结了槐花丸治疗结肠炎的主要成分、主要作用成分、活性成分、核心靶点及信号通路.通过绘制药物成分-疾病靶点网络、药物蛋白与蛋白相互作用网络等多条途径，对槐花丸治疗结肠炎的作用机制进行了研究和初探，为其他研究提供了线索和材料，其实际作用机制还有待进一步实验验证.