藏猪流行性腹泻病毒感染诊断

2021-10-22徐林张朝辉汤承张斌

四川畜牧兽医 2021年10期

关键词：分析检测

徐林，张朝辉，汤承，张斌

（1.四川省甘孜州动物疫病预防控制中心，四川康定 626000；2.西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都 610041）

猪流行性腹泻病毒（PEDV）可引发猪只严重腹泻。PEDV基因组编码的刺突Spike（S）蛋白在感染宿主的过程中具有重要作用，分析S 基因可了解PEDV毒株分子特征。藏猪主要生活在青藏高原，腹泻是严重危害藏猪仔猪的常见疾病。

1 实验材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料某规模化藏猪场病猪的新鲜粪便样本。

1.1.2 主要试剂和仪器 Trizol 试剂盒（RNAiso Plus），DEPC，无水乙醇，异丙醇，QuickTaq HS DyeMix，Marker II，PrimerScriptTMRT 试剂盒，LB培养基，高速离心机等。

1.1.3 引物检测引物序列如表1。

表1 检测引物序列信息表

1.2 方法

1.2.1 核酸提取粪便样本经处理后提取总RNA。利用PrimeScriptTMRT 试剂盒将RNA 反转录成cDNA。

1.2.2 RT-PCR检测腹泻病原按照各个病毒检测引物相应的反应体系进行PCR 扩增反应，退火温度均为51 ℃。反应体系为：Quick Taq HS DyeMix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 3 μL。反应程序为：94 ℃ 2 min，94 ℃30 s，51 ℃30 s，72 ℃30 s，循环36次，72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。

1.2.3 PCR 产物的克隆、转化及测序对检测呈阳性的PCR 产物进行纯化。按照PCR 纯化试剂盒说明书进行操作，以纯化目的条带。按照pMD19-T 载体说明书进行操作，进行连接。将上述的连接产物按照感受态细胞E.coli DH5α操作说明书进行转化。阳性克隆菌液外送测序。

1.2.4 PEDV S基因全基因扩增挑选阳性样本进行完整的S 基因的扩增。PCR 反应体系为：Quick Taq HS DyeMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反应程序为：94 ℃2 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，循环35次，72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。

1.2.5 系列相似性及进化树分析将测序结果进行拼接比对，使用Megalign 6.0 软件和MEGA 7软件等进行序列分析。包括序列的同源性分析以及遗传进化分析。