王鑫,魏琴*,莫开林

1.宜宾学院，四川宜宾 644000；

2.四川省林业科学研究院，四川成都 610081

油樟，学名Cinnamomum longipaniculatum(Gamble) N.Chao ex H.W.Li，是我国能够生产天然芳香油的特有树种，该树种于1974年由四川省林业科学院森林植物分类专家赵良能发现并命名[1]。油樟精油中含55%以上的1,8-桉叶油素，1,8-桉叶油素应用面广，需求量大，但从香料植物油樟中提取收原材料资源限制，其产量有限。因此，探索一种使用油樟内生细菌通过发酵工程直接生产1,8-桉叶油素的生产工艺具有较广阔的研究空间。本文在前期筛选出高产1,8-桉叶油素油樟内生细菌的基础上[2,3]，对发酵条件优化做了一个较为系统的研究，优选出1,8-桉叶油素内生细菌最佳发酵条件，为发酵工程人工生产1,8-桉叶油素奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 生物材料

油樟1,8-桉叶油素内生细菌，自制。

1.1.2 药品试剂

表1 药品试剂Tab.1 Pharmaceutical reagents

1.2 仪器设备

表2 主要仪器Tab.2 Main equipments

1.3 试验设计

1.3.1 发酵时间的确定

取15个100 mL锥形瓶，超声波清洗干净，70℃烘干备用。每个锥形瓶冷却至室温，分别加入40 mL LB液体培养基，封口膜覆盖、橡皮筋缠绕密封，置于高压灭菌锅设置温度121℃、灭菌时间20 min，灭菌结束后取出锥形瓶，置于超净工作台紫外线照射冷却至室温。设置发酵时间为五个梯度水平，即10 h、15 h、20 h、25 h、30 h，无菌条件下接种目标菌株，置于35℃，140 r·min−1恒温摇床培养箱中按发酵时间梯度分别进行发酵，每一个发酵时间水平内发酵3个锥形瓶，作为平行实验。发酵完成后测定1,8-桉叶油素产量，优选出最适宜的发酵温度。

1.3.2 发酵转速（溶氧）的确定

对发酵培养转速优选的实验设计5个梯度，即转速为120 r·min−1、130 r·min−1、140 r·min−1、150 r·min−1、160 r·min−1。在筛选出的发酵时间为20 h的基础上，每个转速梯度设置3个平行。发酵结束后测定1,8-桉叶油素产量，优选出最适宜的发酵培养转速。

1.3.3 发酵pH值的确定

对发酵pH值优选的实验设计5个梯度，pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。在筛选出的发酵时间为20 h、发酵培养转速为150 r·min−1的基础上，每个pH值梯度设置3个平行实验。发酵结束后测定1,8-桉叶油素产量，优选出最适宜的发酵pH值。

1.3.4 发酵温度的确定

对发酵温度优选的实验设计5个梯度，即29℃、31℃、33℃、35℃、37℃。在筛选出的发酵时间为20 h、发酵培养转速为150 r·min−1、发酵pH为6.5的基础上，每个温度梯度设置3个平行实验。发酵结束后测定1,8-桉叶油素产量，优选出最适宜的发酵温度。

1.4 数据处理

本试验数据用Excel 2016软件和SPSS软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 发酵时间对1,8-桉叶油素产量的影响

以不同的发酵时间为基础进行的发酵时间优化实验，所得1,8-桉叶油素的产量情况如图1（a）所示。以5个梯度水平的发酵时间对目标菌株进行发酵时间优化，随着发酵时间增加，产量由最开始的10 h时1.80 mg·L−1开始呈现稳定上升趋势，在发酵时间为20 h时，1,8-桉叶油素产量达到最高为2.67 mg·L−1，发酵时间继续延长，当超过20 h后，其产量显著降低。因此发酵时间过短或者过长，都会影响1,8-桉叶油素的产量，发酵时间确定为20 h最为适宜。

2.2 发酵培养转速对1,8-桉叶油素产量的影响

以不同的发酵培养转速为基础进行的发酵转速优化实验，所得1,8-桉叶油素的产量情况如图1（b）所示。以5个梯度水平的发酵培养转速对目标菌株进行发酵条件优化，随着发酵培养转速增加，产量由最低的120 r·min−1时1.08 mg·L−1开始呈现稳定上升趋势，在150 r·min−1时达到最高产量3.08 mg·L−1，当发酵培养转速超过150 r·min−1后，产量显著降低。因此发酵培养转速过低或者过高，都会影响1,8-桉叶油素的产量，发酵培养转速确定为150 r·min−1最为适宜。

2.3 发酵p H值对1,8-桉叶油素产量的影响

以不同的发酵pH值为基础进行的发酵pH值优化实验，所得1,8-桉叶油素的产量情况如图1（c）所示。以5个梯度水平的发酵pH值对目标菌株进行发酵条件优化，随着发酵pH值增加，产量由初始的pH值=6.0时2.00 mg·L−1呈现上升趋势，在pH值=6.5时达到最高产量6.53 mg·L−1，当发酵pH值超过6.5后，产量显著降低并趋于稳定。因此发酵pH值过低或者过高，都会影响1,8-桉叶油素的产量，发酵pH值确定为6.5最为适宜。

图1 发酵工艺条件对产量的影响Fig.1 Effect of fermentation conditionson yield

2.4 培养温度对1,8-桉叶油素产量的影响

以不同的发酵温度为基础进行的发酵温度优化实验，所得1,8-桉叶油素的产量情况如图1（d）所示。以5个梯度水平的发酵温度对目标菌株进行发酵条件优化，随着发酵温度增加，产量由初始的温度29℃时5.26 mg·L−1呈现为上升趋势，在31℃时达到最高产量9.68 mg·L−1，当发酵温度超过31℃后，产量显著降低并趋于稳定。因此发酵温度过低或者过高，都会影响1,8-桉叶油素的产量，发酵温度确定为31℃最为适宜。

3 结论

本研究通过单因素优化实验，确定了油樟1,8-桉叶油素内生细菌最佳发酵条件工艺参数为：发酵温度为31℃、发酵转速（溶氧）为150 r·min−1、发酵为pH值6.5、发酵时间为20 h。在单因素优化实验筛选出的最佳发酵条件下，产量由未优化时的2.30 mg·L−1增长至9.68 mg·L−1，产量增长率为320.8%。