王佳俊，陈青垚，王 建*，袁健梅

1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137

2.江西中医药大学 现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）属于一种慢性特异性炎症性肠病，其病变部位常始于直肠，逆行而上，可累及全结肠与末端回肠，呈连续弥漫性分布。据报道，UC 更多见于年轻群体，30～40岁的成年人是疾病发作的高峰年龄阶段[1-2]。UC 无性别差异，近年来，发病率和患病率在全世界范围呈上升趋势，且在发达国家的发病率高于发展中国家。其发病机制复杂，涉及遗传、环境、自身免疫和易感基因等因素，可导致腹痛、腹泻、便血等症状，且具有癌变倾向并伴随多种肠外症状，严重影响患者的生活质量，所以WHO 将其确定为现代难治疾病之一[3-4]。根据其临床表现，UC 在中医古籍中多被称为肠澼、泄泻、下痢等。如《素问·太阴阳明论》云：“故犯贼风虚邪者，阳受之……下为飧泄，久为肠澼。”《景岳全书·卷二十四·泄泻》载：“凡《内经》有言飧泄者，有言濡泄者，皆泄泻也；有言肠澼者，即下痢也。”对于UC 的病因病机，中医理论认为多为外感六淫、情志失调、饮食不节等多种病因相互错杂，损伤脾胃而致病。病程中始终存在脾虚湿聚的病机变化，因此脾肾虚衰是本病的必然转归，临床上多在补脾肾的基础上分期、分型而辨证施治[5-6]。

黄连为多年生草本植物毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch.、三角叶黄连C.deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao 或云连C.teetaWall.的干燥根茎，性寒，味苦，归心、胃、肝、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，常用于湿热泻痢、呕吐等症，古今均视为治痢要药[7]。《神农本草经》记载：“黄连主热气，目痛，眦伤，泣出，肠澼，腹痛，下利。”《名医别录》强调其：“微寒，无毒。主治五藏冷热，久下泄澼、脓血。”现代研究表明，除主要成分小檗碱外，黄连尚含黄连碱、巴马汀、阿魏酸、绿原酸等化学成分，具有调节胃肠运动、抗溃疡、抗炎、抗病毒等作用[8-9]。将含黄连煎剂用于治疗UC患者，可通过调节神经内分泌和改善机体免疫功能，修复肠黏膜，愈合溃疡，其抗UC 的作用机制与调节肠道菌群、降低粪中性粒细胞衍生蛋白的含量、抗氧化应激等有关[10-13]。然而目前关于黄连治疗UC 的分子生物学研究尚不够深入且缺系统性评价方法。

中医药数据挖掘研究是将我国丰富的中医药古籍和现代信息技术相结合，挖掘药物之间的相互规律及内在联系，是中医药信息发展过程中的重要内容[14-15]。2020年6月2日，习近平总书记主持召开专家学者座谈会并强调“要加强古典医籍精华的梳理和挖掘，建设一批科研支撑平台，改革完善中药审评审批机制，促进中药新药研发和产业发展。”本文以IBΜ SPSS Μodeler 18.0 关联规则挖掘方剂数据库，归纳黄连高频、强相关的药物组合；通过网络药理学探究高频对药治疗UC 的潜在作用机制，并利用分子对接实现初步验证。从“中药-成分-疾病-靶点-组织分布-通路”角度进行分析，以期为黄连方剂加减配伍用于治疗UC 的临床实践提供理论支撑，整体研究思路如图1所示。

图1 含黄连核心药物组治疗UC 的作用机制研究思路Fig.1 Research ideas on mechanism of core drug groups containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

1 材料与方法

1.1 处方数据来源

用于治疗UC 的含黄连方剂来源于中国中医科学院中医药信息研究所的中国方剂数据库（http://cintmed.cintcm.com/cintmed/），该数据库收录从古至今的中药方剂，时间跨度长，方剂数据可靠。

1.2 处方筛选与数据标准化

依据中医理论对UC 病名的认识，检索关键词设定为主治“久泻OR 肠澼OR 泄泻OR 便血”和核心药物“黄连”，得到方剂259 首，并进行筛选。筛选标准如下：①剔除外用方剂，仅保留内服方剂；②剔除处方药物组成无黄连而加减方中有黄连的方剂；③剔除仅含有黄连一味药的方剂；④剔除1911年以后的现代方剂。数据标准化处理：对于不同产地、不同炮制方法、不同入药部位但功能一致的药物计为同一味药；依据《中国药典》2020年版、《中华本草》[16]的药物名称进行药名标准化处理。

1.3 数据关联分析

利用IBΜ SPSS Μodeler 18.0软件[17]，基于Apriori算法对已筛选的含黄连方剂进行关联规则分析，包括支持度（support）、置信度（confidence）和提升度（lift）3 个指标，设置同时满足支持度≥0.25，置信度≥0.9且提升度≥1 的药对为黄连核心药物组[18]。

1.4 中药成分与作用靶点的筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCΜSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[19]，HERB本草组鉴（http://herb.ac.cn/）、TCΜID 数据库（http://119.3.41.228:8000/tcmid/）和近3年来的相关文献报道以检索相应的中药成分。TCΜSP 上查找的中药成分以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为条件筛选其对应的靶点，其他方式检索到的中药成分则利用Swiss Target Prediction 和SwissADΜE网站进行相应操作。利用UniPort（https://www.uniprot.org/）数据库将靶点转换为基因名。在GeneCard（https://www.genecards.org/）和 OΜIΜ（https://omim.org/）数据库中，以“Ulcerative colitis”为关键词搜索疾病靶点，将成分靶点与疾病靶点进行映射，获得黄连核心药物组治疗UC 的潜在靶点。

1.5 构建与分析成分-靶点网络图

使用Cytoscape3.7.1 软件[20]对构建中药-成分-潜在靶点可视化网络图。

1.6 关键靶点提取和构建蛋白互相作用（proteinprotein interaction network，PPI）网络

将潜在靶点导入STRING 11.0 数据库（https://string-db.org/）[21]，物种设置为homo sapiens，以综合得分（combined score）≥0.7 为筛选条件并删除游离节点，得到蛋白相互作用关系，下载tsv 格式的结果文件并导入Cytoscape 3.7.1 软件，使用该软件中的network analyzer 进行网络拓扑分析，以度（degree）≥2 倍中位数的靶点为关键靶点构建PPI 网络。

1.7 构建潜在靶点组织分布网络

根据HPA 数据库（https://www.proteinatlas.org/）的tissue atlas 模块构建靶点组织分布图，归纳并揭示潜在靶点在人体组织中的分布。

1.8 通路富集分析

利用Μetascape（https://metascape.org/）对黄连核心药物组潜在靶点进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，建立中药-成分-靶点-通路（前20 条与UC 相关）对应关系，并利用微生信网站（http://www.bioinformatics.com.cn/?p=1）进行可视化。

1.9 分子对接验证

采用分子对接软件AUTODOCK 4 对PPI 网络中每味中药对应度值最大的靶点进行分子对接验证[22]。RCSB PDB 数据库（http://www.rcsb.org/）[23]和ZINC数据库（http://zinc.docking.org/）[24]被用于获取靶蛋白和配体结构，对接结果以结合能的形式展示，分值越小说明结合越稳定。

2 结果

2.1 处方统计与分析

从中医药在线数据库筛选出161 首符合要求的标准方剂，共有200 味中药参与组方。其中使用频数≥4 次的药物共72 味，合计使用次数1351 次。关联规则结果显示含黄连方剂中高频药对39 对，使用频数均≥15 次，如表1所示。72 味中药依据《临床中药学》（第2 版）[25]进行分类，如表2所示。结果显示黄连治疗UC 症状常与补气药、行气药、清热药、利水渗湿药、补血药配伍使用，与黄连高频配伍排名前10 味的中药多为味甘、性温之品；归脾、肺2 经；疗效上多可益气健脾、行气止痛、利水渗湿，这种用药特点与中医理论对“肠澼”的基本病机“脾虚湿盛”相符。

表1 治疗UC 的含黄连方剂药物之间的关联关系Table 1 Medicines relationship between prescriptions containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

表2 治疗UC 的含黄连方剂药物类别分析Table 2 Analysis of medicine types of prescriptions containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

2.2 高频核心药物组

在关联规则分析中，筛选符合“1.3”项下条件的中药组成核心药物组，结果与上述高频药物吻合，如表3所示。《得配本草》云：“白术佐川连去湿火”，《药品经义》记载：“木香，香能通气，和合五脏，为调诸气要药……同黄芩、黄连治痢疾”。当归配伍茯苓功能补益气血、健脾止泻，适用于脾胃久虚、泄泻不止。《历代本草药性汇解》提出甘草“性缓，善解诸急”又“补脾胃不足，能大泻心火需用之”的观点。故以紧密相关的6 味中药（黄连、木香、茯苓、甘草、当归、白术）作为黄连核心药物组。

表3 治疗UC 的含黄连方剂核心药对Table 3 Core drug pair of prescriptions containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

2.3 成分-靶点网络构建

根据“1.4”项下设定的条件筛选得到144 个核心药物组的中药成分，其中黄连、甘草、茯苓、木香、白术、当归分别有13、98、15、8、7、12 个成分。成分靶点与疾病靶点映射得到165 个潜在靶点。使用Cytoscape 3.7.1 软件构建疾病-中药-成分-潜在靶点网络图，网络共有1 个绿色节点（疾病），6 个青绿色节点（中药），144 个紫色节点（成分），165个蓝色节点（潜在靶点），共有2202 条边（图2）。

图2 含黄连核心药物组的成分靶点与UC 靶点的网络分析Fig.2 Network analysis of component targets and UC targets of core drug groups containing Coptidis Rhizoma

2.4 关键靶点筛选和PPI 网络构建

将自STRING11.0 网站上下载的tsv 格式文件导入Cytoscape 3.7.1 软件中，并利用network analyzer[26]插件进行网络拓扑学分析，网络的平均度值为17，网络中心性0.518，靶点度值中位数14，以度≥2倍中位数的靶点构建PPI 网络，关键靶点如表4所示。网络（图3）中共有31 个关键靶点及343 条连线，颜色越红，节点越大，靶点度值越大，即这些靶点可能与UC 具有强相关性。

表4 含黄连核心药物组治疗UC 的关键靶点信息Table 4 Key target information of core drug groups containing Coptis Rhizoma in treatment of UC

续表4

图3 含黄连核心药物组治疗UC 关键靶点PPI 网络Fig.3 PPI network of key target protein of core drug groups containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

2.5 潜在靶点组织分布网络构建

在HPA 网站的tissue atlas 模块查询潜在靶点在人体组织中的分布，使用Cytoscape 3.7.1 软件构建潜在靶点-组织分布网络图，网络共有174 个节点和547 条边，如图4所示，圆形节点表示潜在靶点，箭头节点表示组织器官，箭头越大，颜色越深，表明该组织分布的靶点越多，显示潜在靶点在骨髓和淋巴组织（83 个）、女性组织（74 个）、肝胆（52个）、内分泌组织（48 个）、肾脏与膀胱（43 个）高表达。

图4 含黄连核心药物组潜在靶点-组织分布Fig.4 Potential target-tissue distribution of core drug groups containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

2.6 KEGG 通路富集分析

利用Μetascape 网站对含黄连核心药物组治疗UC 的158 个潜在靶点进行KEGG 富集分析，设置P＜0.01，重叠值≥3，富集值≥1.5 为筛选调节，按count 值从大到小排序，前20 条通路的具体信息如图5所示。其中近一半的通路与炎症相关，提示含黄连核心药物组治疗UC 的分子机制可能与炎症反应最为相关。

图5 含黄连核心药物组治疗UC 潜在靶点的前20 条KEGG 通路Fig.5 Top 20 KEGG pathways of potential targets of core drug groups containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

2.7 网络可视化分析

应用Cytoscape 3.7.1 软件对158 个潜在靶点、147 个中药成分和前20 条通路进行可视化操作，构建网络图，如图6所示，由上而下的靶点分别表示中药、成分、靶点、前20 条通路。由图6表明含黄连核心药物组通过多组分、多靶点、多通路发挥对UC 的治疗作用。

图6 含黄连核心药物组治疗UC 的中药-成分-靶点-通路网络Fig.6 TCM-component-target-pathway network of core drug groups containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

2.8 分子对接验证

在核心药物组众多成分对应的靶点中，筛选出度值较大的靶点为受体，与每味药相应成分进行分子对接验证，分别找到6 对对接组合：小檗碱与AKT1、豆甾醇与PTGS2、槲皮素与TP53、3β-乙酞氧基苍术酮与AR、β-谷甾醇与原癌基因JUN、常春藤皂苷元与PTGS2。以对接后配体分子与原配体分子的均方根偏差（root-mean-square deviation，RΜSD）的大小作为判断软件参数设置的合理性以及程序对于该蛋白受体配体复合物的适用性，一般认为该值小于0.2 时表明对接参数设置合理。以受体蛋白原配体的结合能为参照，进行靶点对接。对接结果如表5所示，结果表明受体蛋白与中药成分的对接活性好，且与原配体的结合能相近，其中当归中的β-谷甾醇与JUN 具有最低的结合能，分子结合模式如图7所示。

图7 含黄连核心药物组潜在治疗靶点与对应中药成分对接模式Fig.7 Docking model of potential targets and corresponding ingredients of core drug groups containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

表5 含黄连核心药物组潜在治疗靶点与对应中药成分对接结果Table 5 Molecular docking results of potential targets and corresponding ingredients of core drug group containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

3 讨论

UC 是常见的消化系统疑难病，影响着全人类的健康。中医认为UC 的基本病机为本虚标实证，本虚责之于脾，标实多以湿热互结为主[27]。《医宗金鉴》言：“泻皆成于湿，湿皆本于脾胃。”《景岳全书》曰：“凡里急后重者……而其病本，则不在广肠，而在脾肾”又“泄泻之本，无不由脾胃”。并在治疗总则上主张采用扶正祛邪的方法，扶正强调补脾益气，而祛邪重在清热燥湿[28]。

本研究利用中医药在线数据库收集用于治疗UC 的含黄连方剂，共收集到方剂161 首，涉及200味中药，39 对主要药对。与黄连配伍治疗UC 的药物多为清热药、补气药、行气药、利水渗湿药及补血药，配伍后综合发挥利湿、健脾、行气、止痛功效；黄连配伍清热药重在清热燥湿解毒，以除UC湿热内蕴之象，加之利水渗湿药，以减轻水湿雍滞肠道而导致的腹痛、腹泻样症状；补气药、行气药与补血药同用，气血共治，在于针对UC 脾虚湿热而导致气血失调，湿热搏结气血而为便血之症。在中药配伍规律方面，黄连与木香、甘草、白术、当归、茯苓之间具有强关联性而形成重要的配伍药对。黄连苦寒，擅长清脾胃大肠湿热，白术功能补气健脾而又燥湿，两药配伍，清热燥湿、补气健脾，补泻并行；木香温通性燥，善通行肠胃气滞而缓解腹胀、腹痛；当归辛温行散，补血活血止痛，二药配黄连，寒热并用，起“行血则便脓自愈，调气则后重自除”之效，而且可以兼顾湿热壅滞肠道，耗伤阴血之虑；茯苓甘淡而利水渗湿，健脾助其运化水湿，标本兼顾；甘草为缓急止痛之品，可调和诸药。含这6 味核心药物治疗UC 的方剂有香归白术散、当归芍药汤、加味香连散等。这些核心药物多具味甘、苦，性温、平，主归脾胃2 经的性能特点，其针对UC 患者脾虚、湿盛的基本病机和腹痛、便血、里急后重等临床症状，而发挥补脾、补气血而扶正，燥湿、止痛、止痢而祛邪治标，共同改善脾胃虚弱、水湿内停、泻痢后重的UC 病证，可为其后开发用于治疗UC 的新型黄连组方提供参考。

含黄连核心药物组潜在靶点组织分布结果显示，83 个潜在靶点在骨髓与淋巴组织中高表达。近年来研究表明，骨髓间充质干细胞定向移植在受损结肠部位可通过增加肠上皮细胞的增殖、促进肠道黏膜微环境的重建，从而使肠道恢复正常功能，且骨髓为主要造血器官，骨髓细胞的增殖可增强机体造血能力，在一定程度上改善UC 便血带来的缺血样症状。淋巴系统紊乱，即自体免疫功能失调，是UC 发病的重要机制之一。淋巴细胞在肠道系统与机体免疫系统调节中发挥着重要的媒介作用，当肠腔内细菌由于肠屏障被破坏而进入血液系统，向免疫系统传递伤害信号，诱导淋巴细胞释放大量炎症因子从而引起自身免疫反应过度，导致肠道炎症的发生。同时，靶点多组织分布的特点，体现了机体的整体性，表明核心药物组有治疗UC 合并其他病症的潜能。

黄连具有广谱抗病原微生物和抗炎的药理作用。研究报道显示，黄连所含主要活性成分小檗碱能抑制肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、IL-6、IL-8 等炎性因子的产生和分泌，在抗黏膜炎症方面效果确切[29]。药对是依据中医配伍理论形成的2 味相对固定的药物配对，研究相对固定的中药配伍，可为后续方剂的开发利用提供有效的理论支撑[30]。本研究将5 组具有较强关联的药对设定为含黄连核心药物组，利用网络药理学等研究手段，微观探索其治疗UC 的潜在分子机制。KEGG 通路富集分析显示其涉及磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）、IL-17、晚期糖基化终产物及其受体（advanced glycation end products-receptor advanced glycation end products，AGE-RAGE）、TNF-α 等UC 相关通路。IL-17 是主要由活化的辅助性T 细胞17（T helper cell 17，Th17）产生的炎症因子，可促进T 细胞的激活和刺激细胞黏附分子1（cellular adhesion molecule 1，ICAΜ-1），引发炎症级联反应[31]。研究显示，AGE-RAGE 信号通路可通过激活PI3K-Akt 信号通路介导结肠上皮细胞迁移、增殖和凋亡[32]；在激活PI3K-Akt 通路后，磷酸化的Akt 可以通过增强人核因子κB 抑制蛋白（IκB）的磷酸化和减少IκB 的合成来激活核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）[33]。NF-κB 的活化促进了促炎细胞因子TNF-α 和IL-1β 等的表达和分泌，导致细胞因子含量失衡[34]；而TNF-α 介导的紧密连接蛋白缺陷会破环肠屏障完整性，导致一系列的炎症反应和黏膜损伤发生[35-36]；提示UC 的发生与机体免疫反应异常引起的细胞因子表达失衡和肠屏障被破坏有关。

网络药理学从系统性和整体性的方向对中药的物质基础和作用机制展开研究，为中药药效成分的探索提供了新思路[37-38]。本研究构建的“中药-成分-靶点”网络涉及6 味中药，137 个中药成分以及158 个潜在靶点。分子对接验证结果显示黄连和甘草共有的成分槲皮素与靶蛋白的结合能较低，稳定性较好。有实验证实，槲皮素可通过减轻肠道微血管内皮细胞中黏附分子的表达，减少肠道炎性细胞浸润而控制肠道炎症[39]。甘草所含的山柰酚通过核因子NF-E2 相关因子（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）途径介导诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的产生，降低HepG2-C8 细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RON）的含量，进而达到抗UC 作用[40]。

PPI 网络图表明含黄连核心药物组治疗UC 与AKT1、TP53、ΜAPK1、IL-6 和ΜAPK8 蛋白的关系较大。IL-6 是一种主要由淋巴细胞产生的多功能细胞因子，在肿瘤细胞的增殖和凋亡及细胞免疫中起着重要的作用。研究表明，阻断该信号通路可改善小鼠实验性结肠炎[41]。TP53 是目前与人类肿瘤相关性最高的基因，其突变常见于炎症性肠病相关的结肠癌中，研究发现，槲皮素可通过下调ROS、COX-2 和PI3K 而减少P53 突变为TP53 的比例，从而发挥抑癌及免疫调节作用[42]。ΜAPK1 和ΜAPK8 属于ΜAPK 家族蛋白，在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用，多用于自身免疫性相关疾病中[43]。AKT1 是一种自噬相关基因，参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程，实验研究表明，AKT1 蛋白的泛素化可通过增强自噬作用而降低UC 小鼠炎症因子的表达[44]。综上所述，作用靶点可能通过降低炎症因子表达，调节机体免疫功能维持肠道微环境的稳态从而治疗UC，这也间接证明了网络药理学研究的可行性，是预测活性成分靶点的有力工具。

由于中药方剂成分的多样性，机体吸收、分布、代谢等复杂性，使得深度挖掘中药药效物质基础和临床价值成为中药现代化的必由之路[45]。网络药理学从多学科的技术内容和多层次的网络整合，探索药物与疾病之间的潜在关系，其全面、系统的研究思想与中医整体观念不谋而合[46]。故本研究基于对中医药在线数据库的系统筛查，归纳并总结黄连在治疗UC 方面的用药配伍规律及常用药对，借助网络药理学研究策略，整合多种数据库资料并利用分子对接软件进行验证，初步阐明含黄连核心药物组多组分、多靶点的抗UC特点，揭示其与炎症-免疫-肠屏障之间的内在联系。但鉴于方剂配伍理论的复杂性及网络药理学仍处于发展的早期阶段，还存在着数据库信息收录偏倚，如药物成分的分离鉴定尚未区分药用部位和非药用部位，这可能会导致药效成分对靶标的作用与临床实际用药不符而无法准确预测药物与疾病之间的量效关系等问题；此外，在PPI 网络的蛋白互作关系中，仅考虑度值量的大小而忽略边的属性，同样会对分析结果造成影响；加之不少中药均含槲皮素，黄连核心药物组是否通过槲皮素作用靶点改善UC，其与小檗碱作用机制是否相同，且相关药效成分、潜在靶点及通路等问题均有待进一步通过实验加以验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突