南 楠，许永崧，李美景，龚慕辛*，郭中原，徐 睿，骆思源，王智民

1.首都医科大学中医药学院，北京 100069

2.中医络病研究北京市重点实验室，北京 100069

3.首都医科大学附属北京潞河医院内分泌代谢与免疫性疾病中心，北京 101149

4.糖尿病防治研究北京市重点实验室，北京 101149

5.中国中医科学院中药研究所，北京 100700

6.河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046

偏头痛（migraine）作为反复或周期性发作的一侧或两侧搏动性头痛，常伴有恶心、呕吐、畏光等自主神经症状，是一种高致残和高负担的神经系统疾病，现有的治疗方法对症状的改善有一定的作用，但存在有效率低、副作用大、复发率高等问题，因此，需要寻找更有效、更经济、耐受性更好的治疗方法。吴茱萸汤（Wuzhuyu Decoction）首载于汉代张仲景《伤寒论》，以吴茱萸、人参、生姜、大枣4 味药组成，主治“干呕吐涎沫，头痛者”，是后世医家治疗肝胃虚寒、浊阴上逆型偏头痛的代表方剂。既往临床研究发现吴茱萸汤可以有效减少头痛发作次数和持续时间且安全性好[1-2]，但其有效成分和作用机制尚不完全清楚。

本课题组前期对吴茱萸汤中改善偏头痛的有效成分[3]和吴茱萸汤外翻肠囊吸收的可检测原型成分与药效间的相关性[4]进行了研究，结果发现柠檬黄素-3-O-β-D-葡萄糖苷（limocitrin-3-O-β-D-glucoside，Lcs）、人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1，Rg1）、人参皂苷Re（ginsenoside Re，Re）、人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb1，Rb1）、吴茱萸苦素（rutaevin，Rv）、柠檬苦素（limonin，Li）、吴茱萸碱（evodiamine，Ev）、6-姜辣素（6-gingerol，6-Gi）和吴茱萸次碱（rutecarpine，Ru）对偏头痛药效指标具有不同程度的影响，但2 种谱效相关实验得到的部分成分的作用趋向相反，如Rb1在吴茱萸汤中含量越高对药效越好，但在外翻肠囊吸收谱效相关研究中却显示Rb1进入肠囊越少对药效越有利。考虑外翻肠囊吸收属于离体实验，可能导致结果与实际情况不同，因此，本研究进一步采用单向在体肠灌流方法，对吴茱萸汤中上述成分肠吸收量与药效间的相关性进行探究。

除上述成分外，吴茱萸汤作为水煎剂仍含有其他复杂成分，成分间可能在体内过程中存在协同或拮抗作用，并影响疗效。这些成分治疗偏头痛的作用机制和成分间的相互影响尚未明确，因此，本实验采用网络药理学方法对吴茱萸汤中包括上述成分在内的活性成分和作用靶点等进行推测，为明确吴茱萸汤治疗偏头痛的药效成分和机制研究提供新的思路和视角。

1 材料

1.1 仪器与材料

BT100-1L 蠕动泵（保定兰格恒流泵有限公司）；Agilent 1100系列高效液相色谱系统（Agilent公司）；ΜG-2200 氮吹仪（EYELA 公司）；ALPHA 1-2 PLUS冷冻干燥机（Christ 公司，德国）。

1.2 药品与试剂

利血平注射液（规格 1 mg︰1 mL，批号1509071，广东邦民药业有限公司），琥珀酸舒马曲坦片（以琥珀酸舒马曲坦计 100 mg/片，批号4G6919T，天津华金药业有限公司），一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和考马斯亮蓝试剂盒（南京建成生物工程研究所）。Ev（批号110801-200908，质量分数99.7%）、Ru（批号110801-201207，质量分数99.4%）、Li（批号110801-201205，质量分数 88.5%）、Rg1（批号110703-201128，质量分数 93.4%）、Re（批号110754-201123，质量分数 89.1%）、Rb1（批号110704-201223，质量分数 95.9%）、6-Gi（批号111833-201102，质量分数98.6%），以上对照品均购自中国食品药品检定研究院；Lcs（自制，质量分数≥95%）；5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）（批号BCBP2642V，质量分数≥98%）、5-羟吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA，批号BCBP2642V，质量分数≥98%）、多巴胺（dopamine，DA，批号H8502-5G，质量分数≥98%）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE，批号H7752-250ΜG，质量分数≥97%），内标物 3,4-二羟基苄胺（3,4-dihydroxy-benzylamine，3,4-DHBA，批号16290-26-9，质量分数98%），以上对照品及内标物均购自Sigma 公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）均购自ThermoFisher 公司。

1.3 动物

SPF 级SD 雄性大鼠，7～8 周龄，体质量280～320 g，合格证号为SCXK（京）2016-0011；SPF 级ICR 小鼠，雌雄各半，7～8 周龄，体质量28～32 g，合格证号为SCXK（京）2012-0001，均购自维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养在室温（25±2）℃、湿度（50±10）%、自由摄食和饮水并暴露于12 h 的光/暗交替环境中。动物实验经首都医科大学动物伦理委员会批准（伦理编号 AEEI-2014-128），实验结束采用颈椎脱臼法处死动物。

1.4 吴茱萸汤的制备

吴茱萸、人参、生姜、大枣饮片收集自不同产地（表1），均由首都医科大学中医药学院中药资源教研室罗容教授鉴定为芸香科植物Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.的干燥近成熟果实、五加科植物人参Panax ginsengC.A.Μey.的干燥根和根茎、姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鲜根茎、鼠李科植物枣Ziziphus jujubaΜill.的干燥成熟果实，符合《中国药典》2020年版规定。各药材按照文献方法[3]加水煎煮，共获得10 种吴茱萸汤，质控指标见表2，药液减压干燥成干膏，使用前复溶。

表1 10 种吴茱萸汤饮片组成Table 1 Medicinal slices in 10 kinds of Wuzhuyu Decoction

表2 10 种吴茱萸汤中9 种成分含量Table 2 Conents of nine ingredients in 10 kinds of Wuzhuyu Decoction

2 方法

2.1 大鼠单向在体肠灌流实验

2.1.1 色谱条件 Kromasil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），洗脱梯度如表3所示，柱温30 ℃，检测波长203 nm，体积流量1 mL/min。

表3 HPLC 含量测定梯度洗脱程序Table 3 HPLC gradient elution procedure for content determination

2.1.2 对照品溶液的制备 称取适量各对照品，以甲醇配制成不同质量浓度的混合对照品溶液，取混合对照品溶液 100 μL，加入 K 氏缓冲液（Kreb-Ringer，KR）100 μL，混匀后氮气吹干，100 μL 甲醇复溶，离心取上清，20 μL 进样分析。

2.1.3 供试品溶液的制备 取相当于生药量3.5 g 吴茱萸汤干膏，加入20 mL 甲醇超声30 min，滤过蒸干，色谱甲醇复溶并定容至5 mL，10 μL 进样分析。

2.1.4 标准曲线的制备及线性关系考察 取各对照品溶液，以甲醇配制成不同质量浓度的混合对照品溶液，用0.45 μm 滤膜滤过，按照“2.1.1”项下色谱条件进样20 μL。线性关系考察同文献结果[3]。

2.1.5 准确度、精密度、稳定性及回收率考察 参考文献方法[4]对HPLC 测定方法的准确度与精密度及样品的稳定性、提取回收率进行考察。准确度RSD 均小于15%，日内精密度及日间精密度RSD均小于10%，稳定性试验结果偏差在±5%以内，结果均符合生物样品分析要求。

2.1.6 在体肠灌流样品的制备 参照文献方法[5]配制KR 缓冲液。称取“1.4”项中吴茱萸汤煎液的干燥粉末，用KR 缓冲液配制相应生药浓度的在体肠灌流吸收实验样品溶液，为防止沉淀堵塞肠管，预先进行离心（3000 r/min 离心10 min），取上清液进行灌流。

2.1.7 单向在体肠灌流模型的制备及吸收样品处理参考文献方法[4]制备大鼠在体肠灌流模型并进行灌流液样品的取样。吸收样品溶液的制备：将各样品冷冻干燥后，每200 μL 样品加甲醇500 μL，涡旋混合30 s，超声30 min，3000 r/min 离心5 min，取上层清液。上清液用氮气吹干，每200 μL 样品残渣加甲醇100 μL，涡旋混合30 s，超声5 min。样品用针头过滤器滤过，吸取10 μL 注入HPLC 仪，按照“2.1.1”项色谱条件进行分析。单向在体肠灌流单位面积累积吸收量（M）计算方法公式如下。

M＝V×[Cin－Cout×(Vout/Vin)]×15/(a×b)

M为药物的累积吸收量，Cin为供试液浓度，Cout为收集液样品浓度，Vout为收集液体积，Vin为供试液体积，a 和b 为肠段长度（cm）和周长（cm）

实验中检测的是药液中的原型成分，计算出的是经过肠道后药液中消失成分的量，将其看作被吸收的量，实际上不仅包含被吸收的成分，也可能包含经肠道代谢的成分。为了简便描述，本研究均称作吸收量。

2.2 小鼠偏头痛实验

2.2.1 小鼠偏头痛模型的制备、分组及给药 将小鼠分为14 组，每组12 只，包括对照组、假手术组、模型组、阳性药（舒马曲坦，5.83 mg/kg）组及10组吴茱萸汤治疗组。给药体积均为20 mL/kg。吴茱萸汤组采取预防加治疗的给药模式，实验开始第1天按0.2 mL/10 g 体质量ig 给予相应吴茱萸汤1次/d，对照组、假手术组、模型组每天ig 给予等剂量蒸馏水，阳性药组仅进行治疗给药，从第6 天起ig 舒马普坦。参考文献方法[3]制备小鼠偏头痛模型：第6～13 天，各给药组小鼠sc 0.172 mg/kg 利血平1次/d，假手术组和对照组sc 等量生理盐水；第14天小鼠用3%水合氯醛（450 mg/kg）麻醉，剪开头部皮肤，在前囟下2 mm、矢状缝右侧2 mm 处钻一孔，剪尾取自体血液，自钻孔处注射2 μL 自体血液于大脑皮层，深度1 mm，手术结束后用骨蜡止血，青霉素抗炎，缝合创面，假手术组只钻孔不埋血块，对照组不做处理。第15～21 天各组继续ig 给药。第21 天，各组小鼠麻醉、处死，取心脏混合血液及全脑。

2.2.2 单胺类神经递质及NO 含量、NOS 活力的测定方法 参考文献方法[3]将脑组织匀浆、离心，测定单胺类神经递质；按照试剂盒说明书进行脑组织及血清中NO 含量、NOS 活力的测定。

2.3 统计方法

实验数据采用SPSS 22.0 统计软件进行分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2.4 在体肠灌流吸收量与药效指标相关分析方法

采用Μinitab 17.0（17.1.0.0）中的偏最小二乘回归方法（partial least squares regression，PLSR），将各成分总吸收量分别与药效指标进行相关分析，根据回归系数大小辨识在体肠灌流吸收成分中影响药效指标的主要成分。使用Μatlab 12.0 R2012b（8.0.0.783）编写的程序计算熵值，作为各药效指标在综合药效中的权重。对同一成分与各药效指标的回归系数、各药效指标熵值权重的乘积求和，作为该成分对综合药效的作用趋势。

2.5 网络药理学研究

2.5.1 吴茱萸汤活性成分的筛选 由于中药成分复杂，吴茱萸汤中除上述已测定成分外，尚有大量未测定成分，故本研究利用TCΜSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）数据库[6]和TCΜIP（http://www.tcmip.cn/TCΜIP/index.php/Home/）数据库[7]对吴茱萸汤4 种中药的化学成分进行收集汇总和筛选，去除重复成分。

2.5.2 潜在活性成分作用靶点的预测 为了获得吴茱萸汤潜在活性成分的作用靶点，除利用TCΜSP、TCΜIP 数据库检索外，还采用SwissTargetPrediction[8]（http://www.swisstargetprediction.ch/index.php）和Similarity Ensemble Approach（SEA）[9]（http://sea.bkslab.org/）对上述成分的作用靶点进行预测，建立吴茱萸汤潜在活性成分作用靶点数据库。

2.5.3 偏头痛疾病治疗相关靶点的收集 在TTD[10]（http://db.idrblab.net/ttd/）和 DisGeNET（https://www.disgenet.org/）数据库中，检索获得偏头痛疾病治疗相关靶点信息。利用UniProt 数据库将获得的所有靶点标准化，绘制吴茱萸汤潜在活性成分作用靶点与偏头痛疾病治疗靶点的韦恩图，获得交集靶点用于后续分析。

2.5.4 蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interactions，PPI）网络的构建 利用Stringv11.0[11]（https://string-db.org/）构建吴茱萸汤和偏头痛交集靶点的PPI 关系网络，并对网络进行拓扑学分析，按照拓扑参数平均最短路径（average shortest path length）、接近中心性（closeness centrality）、度（degree）、介数中心性（betweenness centrality）的平均值为标准，筛选获得关键靶点。

2.5.5 基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 利用DAVID 对获得的交集靶点进行GO 富集分析和KEGG 信号通路富集分析，其中以P＜0.05 为筛选条件，认为结果具有显著性。通过上述分析，以深入了解吴茱萸汤治疗偏头痛涉及的生物过程和信号通路。

2.5.6 网络构建 根据药物（drug）、成分（ingredient）、靶点基因名称（gene name）之间以及靶点与信号通路之间的相互作用，建立信息网络，利用Cytoscapev 3.8.0（www.cytoscape.org）对此网络进行可视化分析，同时，构建靶点-信号通路网络图，明确信号通路与靶点之间的相关关系。

2.5.7 成分-靶点分子对接验证 选择“中药-成分-靶点”网络中的关键靶点和成分，利用Discovery Studio 2020 软件进行分子对接，验证关键靶点与成分之间的结合活性。从Pubchem（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中下载活性成分的3D 结构的SDF 文件，PDB 数据库（http://www.rcsb.org）下载靶点蛋白的3D 结构的PDB 文件。通过虚拟筛选中的精准分子对接程序CDOCKER 模块进行计算，将原配体对接到各自的活性口袋中，计算初始复合物中原配体的分子构象与对接后的分子构象的均方根偏差（root mean square deviation，RΜSD），以RΜSD≤2.0 证明对接所得分子构象可以在一定程度上还原配体与受体的结合模式。将吴茱萸汤活性成分对接进入先前定义好的活性口袋中，以对接能作为对接分值的打分指标，对接能的负值越大，说明受体与活性成分的对接亲和力越大，活性也越高[12]，按照原配体与受体对接分值的80%作为阈值，对活性成分和原配体与靶点的结合能力大小进行预测和排序，选择对接打分值高于阈值且作用模式与原配体-受体作用模式近似的化合物作为靶标的潜在抑制剂[13]。

3 结果

3.1 单向在体肠灌流吸收谱效相关结果

3.1.1 单向在体肠灌流吸收谱 实验结果显示不同吴茱萸汤中9 种成分在肠灌流过程中均可被吸收，结果见表4。各组吴茱萸汤中由于成分配比不同，导致同一种成分的吸收量相差较大，这也使中药复方的研究更加的复杂化。

表4 10 种吴茱萸汤9 种成分单向肠灌流单位面积吸收量 (x± s,n=6)Table 4 Absorption per unit area of nine kinds of ingredients in 10 kinds of Wuzhuyu Decoction by single pass intestinal perfusion (x± s,n=6)

3.1.2 单胺类神经递质及NO、NOS 的测定结果利血平耗竭偏头痛小鼠模型药效结果如表5所示，与对照组和假手术组相比，造模后小鼠5-HT、5-HIAA、NE、多巴胺的水平显著降低（P＜0.01），脑中NO、NOS（NO-b、NOS-b）和血清中NOS（NOS-p）的水平显著升高（P＜0.01）；血清中NO（NO-p）的水平显著降低（P＜0.01）。吴茱萸汤组或阳性药组小鼠除DA 外，各指标均得到一定改善。3.1.3 谱效相关分析结果 各药效指标与在体肠灌流吸收量的PLSR 结果见表6。其中正数表示各成分在体吸收量与药效指标呈正相关关系，负数反之。其中药物成分在5-HT、5-HIAA、NE、DA 及血清NO 指标中的回归系数为正，表示该成分对偏头痛改善具有正向作用，为负表示呈负向作用；药物成分在脑组织NO 及血清与脑组织NOS 指标中，回归系数为正表示该成分在体吸收量对偏头痛改善具有负向作用，为负表示具有正向作用。综合趋势可见，在各药效指标中，成分在体吸收越多，疗效越好的前3 位成分为Rv、Lcs、Ru，成分在体吸收越少，疗效越好的前3 位成分为6-Gi、Ev、Rg1。

表5 各小鼠单胺类神经递质和血管活性物质的含量 (±s，n=12)Table 5 Contents of monoamine neurotransmitters and vasoactive substances in mice of each group (±s，n=12)

表5 各小鼠单胺类神经递质和血管活性物质的含量 (±s，n=12)Table 5 Contents of monoamine neurotransmitters and vasoactive substances in mice of each group (±s，n=12)

与对照组比较：△P＜0.05 △△P＜0.01；与模型组比较：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01；NO-b、NOS-b 代表脑中NO、NOS 含量 NO-p、NOS-p 代表血清中NO、NOS 含量△P ＜0.05 △△P ＜0.01 vs control group;▲P ＜0.05 ▲▲P ＜0.01 vs model group;NO-b and NOS-b represent NO and NOS content in brain NO-p and NOS-p represent NO and NOS content in serum

组别 5-HT/(ng·g-1) 5-HIAA/(ng·g-1) DA/(ng·g-1) NE/(ng·g-1)假手术 643.110±107.014▲▲ 377.310±89.668▲ 386.223±128.718▲▲ 439.004±57.942▲▲对照 664.526±63.861 401.609±81.283▲▲ 391.039±94.181 442.259±46.713模型 337.785±84.504△△ 301.904±54.414△△ 242.075±158.621△△ 171.173±65.172△△阳性药 417.810±92.491▲▲ 386.022±115.267▲ 259.308±104.721 188.654±25.649 WZYD-1 427.344±86.341▲ 424.598±62.161▲▲ 238.002±83.673 222.491±37.219▲▲WZYD-2 526.862±95.044▲▲ 488.519±107.66▲▲△△ 282.070±115.021 225.873±40.351▲▲WZYD-3 443.495±96.816▲ 392.581±65.142▲▲ 234.888±83.549 177.888±35.760 WZYD-4 443.097±63.413▲ 393.811±60.828▲▲ 244.404±126.079 196.890±43.600 WZYD-5 496.664±152.423▲▲ 504.176±77.892▲▲△△ 267.604±132.124 224.429±47.589▲▲WZYD-6 492.962±78.320▲ 432.545±71.805▲▲ 256.052±84.982 195.196±46.363 WZYD-7 433.650±107.179▲ 398.836±108.244▲▲ 338.159±141.715 191.963±33.028 WZYD-8 502.575±133.067▲▲ 459.894±54.514▲▲△ 301.118±129.806 240.470±55.478▲▲WZYD-9 486.512±72.174▲▲ 491.213±85.024▲▲△△ 298.839±104.626 239.249±53.514▲▲WZYD-10 496.519±123.627▲▲ 442.538±67.939▲▲ 305.776±107.064 215.693±82.047▲组别 NO-b/(μmol·g-1) NOS-b/(μmol·g-1) NO-p/(μmol·L-1) NOS-p/(μmol·L-1)假手术 0.204±0.090▲▲ 0.274±0.176▲▲ 6.541±3.020 41.382±3.429▲▲对照 0.206±0.094 0.257±0.220 8.992±5.197 39.895±4.912模型 0.425±0.184△△ 0.719±0.477△△ 3.705±3.098△△ 50.688±8.132△△阳性药 0.252±0.137▲ 0.442±0.215▲▲ 3.770±3.163 42.934±5.046▲▲WZYD-1 0.264±0.111▲▲ 0.301±0.216▲▲ 47.712±28.203▲▲ 41.957±6.928▲WZYD-2 0.252±0.087▲▲ 0.357±0.237▲▲ 48.057±25.602▲▲ 43.453±5.200▲WZYD-3 0.334±0.218 0.301±0.212▲▲ 8.146±6.227 42.906±4.442▲▲WZYD-4 0.233±0.117▲▲ 0.295±0.194▲▲ 4.750±4.414 47.639±10.730 WZYD-5 0.264±0.082▲▲ 0.416±0.244▲▲ 17.935±6.520▲ 40.065±6.370▲▲WZYD-6 0.242±0.102▲▲ 0.255±0.181▲▲ 16.952±12.444▲ 39.848±2.443▲▲WZYD-7 0.343±0.159 0.320±0.218▲▲ 13.106±10.452 44.307±6.753▲WZYD-8 0.279±0.137▲▲ 0.361±0.436▲▲ 25.621±16.644▲▲ 45.440±7.591▲WZYD-9 0.215±0.103▲▲ 0.408±0.275▲▲ 20.727±16.112▲▲ 46.103±5.701 WZYD-10 0.274±0.169▲▲ 0.322±0.301▲▲ 16.545±11.290▲ 42.852±6.026▲▲

表6 药效指标与在体肠灌流吸收量的PLSR 分析结果Table 6 Partial least-squares regression analysis of pharmacodynamic indexes and intestinal perfusion absorption in vivo

通过上述结果发现，各成分对不同药效指标存在不同的作用趋势，表明这些成分对偏头痛的治疗均具有一定的疗效，然而中药水煎液成分复杂，除上述成分外仍有大量未进行研究的成分，并且这些成分的作用靶点尚不明确，若对所有靶点逐一验证可行性较低，因此，本研究采用网络药理学的方法，利用数据库和软件检索、计算、分析的方法，快速有效的筛选出药物的有效成分和作用靶点。

3.2 网络药理学结果

3.2.1 吴茱萸汤中抗偏头痛潜在活性成分 共获得112 种活性成分，其中吴茱萸中独有成分39 种、人参独有成分27 种、大枣独有成分26 种、生姜独有成分14 种、大枣和人参共有成分2 种、大枣和吴茱萸共有成分2 种、大枣、人参、生姜共有成分1 种，4 味药物共有成分1 种，即β-谷甾醇（β-sitosterol）。在多项体内外研究中已证明，β-谷甾醇具有镇痛、抗炎、镇静、抗焦虑等作用[14]。含有该成分的杜鹃花科植物Arbutus andrachneL.叶甲醇提取物也对小鼠疼痛模型表现出明显的镇痛作用[15]。

3.2.2 吴茱萸汤治疗偏头痛的靶点 共得到了1517 个潜在活性成分作用靶点和278 个偏头痛治疗靶点。绘制韦恩图共获得112 个吴茱萸汤治疗偏头痛的作用靶点（图1）。

图1 吴茱萸汤潜在活性成分作用靶点与偏头痛治疗靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of potential targets of active ingredient in Wuzhuyu Decoction and targets of migraine therapy

3.2.3 PPI 网络的构建及拓扑分析 通过STRING数据库，构建吴茱萸汤治疗偏头痛靶点的PPI 网络，其中靶点碳酸酐酶14（Carbonic anhydrase 14，CA14）、蛋白酶体组装伴侣1（Proteasome assembly chaperone 1，PSΜG1）与其他110 个靶点之间未获得相互作用的证据，结果如图2-A所示。将PPI 数据导入Cytosape 软件中，其中节点（nodes）110 个，边（edges）882 条。按照平均最短路径≤2.28，接近中心性≥0.45，度≥15.02，介数中心性≥0.012，筛选出31 个关键靶点，如图2-B所示。如血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）可能与其他46 个靶点相关，淀粉样β 蛋白A4 蛋白（amyloid-beta A4 protein，APP）可能与其他45 个靶点相关，这些与其他靶点关系密切，在整个调节网络中起到枢纽的作用，可能是吴茱萸汤治疗偏头痛的关键靶点。

图2 吴茱萸汤治疗偏头痛作用靶点的PPI 网络图 (A) 及关键靶点 (B)Fig.2 PPI network map (A) and key targets (B) of Wuzhuyu Decoction in treatment of migraine

3.2.4 GO 及KEGG 富集分析 为了确定112 个交集靶点抗偏头痛的作用机制，利用DAVID 数据库对这些靶点进行了GO 富集分析，以阐明相关的生物学过程（biological process，BP）、细胞组成（cellularcomponent，CC）和分子功能（Μolecular function，ΜF）。结果3 者分别富集到118、21、21个条目，利用bioinformatics 在线平台（http://www.bioinformatics.com.cn）将各部分的前10 个条目绘制气泡图（图3），气泡越大，富集的靶点越多；气泡颜色越红，校正后P值越小，表示更高的可信度和重要性。其中BP 中富集最显著的包括化学突触传递、对药物的反应、磷脂酶C 激活G 蛋白偶联受体信号通路、促进钙离子释放入胞浆、血管收缩等。CC 富集最显著的包括细胞膜的整体部分、细胞质膜、神经树突、膜筏、神经突起等。ΜF 富集最显著的包括血清素结合、神经递质受体活性、G 蛋白偶联血清素受体活性、药物结合、多巴胺结合等。结果显示，吴茱萸汤治疗偏头痛主要涉及神经元膜蛋白相关的配体-受体结合，从而影响神经信号传导，发挥有效的治疗作用。

图3 吴茱萸汤治疗偏头潜靶点GO 富集分析气泡图Fig.3 Bubble chart of GO enrichment analysis on potential target of Wuzhuyu Decoction in treatment of migraine

利用DAVID 数据库，对吴茱萸汤治疗偏头痛的靶点进行KEGG 通路富集，共富集到24 条信号通路，见图4。图中圆形代表靶点，箭头代表信号通路，面积越大、颜色越深，代表该靶点参与的通路或通路涉及的靶点均越多，说明其在网络中越重要。其中校正P＜0.01 的有14 条，如图5所示，条形越长，代表该信号通路越重要，排名前3 的信号通路分别是神经活性配体受体相互作用、5-HT 能突触信号通路、钙信号通路，均涉及神经递质和突触信号传导，提示吴茱萸汤治疗偏头痛的作用机制可能是通过调节神经信号的传导而发挥作用的。

图4 吴茱萸汤治疗偏头痛靶点与信号通路网络图Fig.4 Network diagram of targets and signal pathways in Wuzhuyu Decoction in treatment of migraine

图5 吴茱萸汤治疗偏头痛信号通路Fig.5 Signal pathways of Wuzhuyu Decoction in treatment of migraine

3.2.5 中药-成分-靶点网络构建及分析 采用Cytoscape 构建中药-成分-靶点网络图，共有220 个节点，1444 条边，如图6-A所示。同时，根据筛选获得的关键靶点，反向寻找其活性成分，从而构建吴茱萸汤治疗偏头痛的关键靶点和成分网络图，如图6-B所示，其中81 种成分作用于2 个及以上靶点，提示这些成分的变化对偏头痛的治疗效果产生重要的影响。吴茱萸中的去甲吴茱萸酰胺、evodione、羟基吴茱萸碱和大枣中的左旋千金藤啶碱作用的靶点均有9 个，这些度值较高的成分有可能在吴茱萸汤缓解偏头痛症状中发挥着相对重要的作用。

图6 吴茱萸汤治疗偏头痛的中药-成分-靶点网络图Fig.6 Network diagram of TCM-component-target of Wuzhuyu Decoction in treatment of migraine

上述节点中度值较高的靶点是多种成分共同作用的部分，被刺激产生作用的可能性大，在偏头痛治疗过程中具有重要意义。吴茱萸汤中有52 种成分共同作用于前列腺素内过氧化物合成酶 2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）靶点，且33 个靶点与该靶点相互作用，这个靶点是参与前列腺素合成、促进炎症反应的关键酶，抑制该酶活性可以有效抑制神经源性炎症反应。5-羟色胺转运体（solute carrier family 6 member 4，SLC6A4），可将5-HT 从突触间隙运回突触前，从而终止5-HT的作用，有40 种成分和25 个靶点作用于该靶点，抑制该靶点的作用可以有效预防偏头痛的发作，这可能是吴茱萸汤治疗和预防偏头痛的另一机制，上述实验研究结果也证实吴茱萸汤治疗后脑干中5-HT 的含量明显升高。瞬时受体电位香草酸亚型1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1），该靶点参与炎症疼痛和痛觉敏化的调节，具有诱导降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）释放的作用，而CGRP 是促进血管扩张和三叉神经痛觉敏化的关键神经递质，是诱发偏头痛发作的重要因素[16]。研究发现，山柰酚、β-谷甾醇、槲皮素等成分可抑制TRPV1 表达而升高热痛伤害阈值，这可能也是吴茱萸汤治疗偏头痛小鼠模型疗效显著的原因之一[17]。从上述分析结果中可看出中药、成分、靶点之间构成了复杂网络，1 种化合物可对应多个靶点，而1 个靶点可被多种成分影响，体现了吴茱萸汤多成分、多靶点的治疗特色。

3.2.6 分子对接 选取关键靶点和成分网络中度值值前3 的靶点，分别是PTGS2（PDBID：1PXX）、SLC6A4（PDBID：5I6X）、TRPV1（PDBID：3SUI），以及这些靶点对应的吴茱萸汤活性成分52、40、26个，将这些成分对接到3 个靶点的活性口袋中，选择CDOCKER 进行对接，其中3SUI 是TRPV1 与钙调蛋白的复合体，没有小分子化合物作为原配体，将其对接阈值设为0。3 个靶点获得9、11、7 个打分值高于阈值的化合物（表5），打分值最高的结合模式图见图7。

图7 潜在活性成分与靶点的相互作用及药效团模型匹配图Fig.7 Interaction between potential active ingredients and target and pharmacophore model matching diagram

表5 筛选得到的3 个靶点的潜在活性成分信息Table 5 Potential active ingredients of screened three targets

4 讨论

临床和基础研究均证实吴茱萸汤治疗偏头痛疗效确切，复方中不同成分及含量对药效指标具有不同程度的影响，表明中药中多种成分之间相互作用，协同或拮抗起效，本研究利用单向在体肠灌流法模拟吴茱萸汤在体内吸收过程，利用PLSR 法对成分的吸收量和药效指标之间进行回归分析，结果表明不同成分对药效指标有不同程度的影响，但这些成分的作用机制并不仅限于对上述药效指标的影响，而且吴茱萸汤中的成分也远远多于上述成分。因此，在此基础上，本研究又采用网络药理学的方法[18]，从整体的角度探索药物与疾病的关联性，强调从药物、靶点与疾病间相互作用的整体性和系统性出发，这与中医整体观念、辨证论治的理论不谋而合，从而分析和预测吴茱萸汤抗偏头痛治疗的成分和作用机制，为中医药治疗疾病的机制研究提供参考。

偏头痛的发作机制主要与三叉神经系统痛觉敏化有关，同时伴有神经源性炎症、硬脑膜血管扩张。临床上常用治疗药物一类是非甾体类抗炎药，另一类是抑制血管扩张药物，包括5-HT 受体激动剂和与CGRP 相关药物。然而，上述药物治疗偏头痛存在胃肠道溃疡出血和发生心脑血管事件的风险，因此，众多学者也将偏头痛的治疗药物转向传统医学，中医药具有辨证论治和用药安全性、耐受性好等特点，其在治疗偏头痛方面具有独特的优势[19]。临床[1]和基础[20]研究均证明吴茱萸汤治疗偏头痛具有明显的疗效和安全性，药效实验结果也表明吴茱萸汤可以有效增加脑5-HT 和5-HIAA 的含量，并降低脑中NO 水平和NOS 活性的作用，从而发挥治疗偏头痛的作用。结合网络药理学分析，提示吴茱萸汤可能是通过抑制脑干中5-羟色胺转运体（serotonin transporter，SERT）的作用，从而增加5-HT 和5-HIAA 含量，抑制NOS1 靶点的作用降低NO 的含量。5-HT、5-HIAA 与血管收缩、神经突触传导关系密切，NO、NOS 与神经源性炎症、血管收缩关系密切[21]。综上，吴茱萸汤可能是通过抑制神经源性炎症、调节血管收缩和影响神经突触传导发挥治疗偏头痛的作用。

神经源性炎症是偏头痛发作的关键环节，也是其病理生理基础，除了NO 外，前列腺素参与各种炎症反应过程，PTGS2 [也称环氧化酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）]是前列腺素合成的关键酶，其表达与炎症的严重性密切相关[22]，研究发现偏头痛动物模型大脑中COX-2 高表达[23]，同样偏头痛患者在发作期血浆COX-2 的表达也明显高于发作间期和健康对照组[21]。非甾体类抗炎药是广泛用于治疗偏头痛的一类药物，其作用机制就是通过改变COX-2 活性，抑制花生四烯酸合成前列腺素，从而抑制神经源性炎症和逆转中枢敏化[24]。通过网络药理学分析结果发现，PTGS2 与吴茱萸汤中的52 种活性成分相关联，并影响5-HT 能突触信号通路、逆行内源性大麻素信号通路、利什曼病、卵巢类固醇生成信号通路、脂肪细胞脂解调节这5 条信号通路，PTGS2 在吴茱萸汤治疗偏头痛的过程中占据了重要的地位，实验研究证实吴茱萸含量较高的2 种主要成分吴茱萸次碱、吴茱萸碱均可以有效抑制前列腺素的合成[25-26]，这2 种成分均对治疗偏头痛有效，吴茱萸碱在改善药效学指标方面起了重要作用[3]。提示吴茱萸汤治疗偏头痛的关键机制之一是抑制神经源性炎症。另外，成年后女性的偏头痛的发病率是男性的2～3 倍[27]，表明雌孕激素与偏头痛的发作也有密切的关系，吴茱萸汤也可调节卵巢类固醇生成信号通路、脂肪细胞脂解，它们与偏头痛的病理机制相关。

另一方面，偏头痛与血管舒缩密切相关，5-HT能信号通路和肾素分泌相关信号通路均涉及血管舒缩功能。5-HT1B/1D 受体（HTR1B/1D）激动剂是偏头痛治疗的常用药物，具有促进血管收缩和抑制CGRP 等神经递质释放的双重作用[28]。吴茱萸酰胺乙、去甲吴茱萸酰胺、吴茱萸酰胺、巴婆碱、荷叶碱、aponorhyoscine、5-甲氧基-N,N-二甲基色胺、无刺枣因S7 可同时作用于HTR1B 和HTR1D 这2个靶点，在促进血管收缩的同时抑制三叉神经系统上行疼痛传导通路，从而阻断痛觉敏化。同时，5-HT能信号通路涉及中枢神经突触信号传导，偏头痛患者脑干中5-HT 能神经元功能受到抑制，使5-HT 分泌减少，导致下行痛觉易化/抑制功能失调，使三叉神经系统持续活化。通过GO 和KEGG 通路富集分析发现，吴茱萸汤治疗偏头痛的分子功能涉及血清素结合活性、神经递质受体活性、G 蛋白耦联的血清素受体活性，并且通过调节神经配体受体相互作用信号通路、5-HT 能神经突触信号通路、钙离子信号通路发挥作用，表明吴茱萸汤治疗偏头痛的作用机制可能是通过调节5-HT 含量发挥作用的。其中5-HT 转运体基因SLC6A4受到40 种成分的共同作用，该基因的表达产物SERT 位于突触前膜上，具有将5-HT 转运到胞质内的作用，抑制该蛋白的活性，可以有效增加突触间5-HT 的浓度，发挥下行痛觉调节作用。阿米替林是三环类抗抑郁药，是最早发现具有预防偏头痛作用的药物之一，其作用机制主要是通过抑制SERT 而发挥治疗作用的，是目前临床中具有B 级证据的推荐预防偏头痛用药[29]。吴茱萸汤中多种成分共同作用于该靶点，本课题组前期研究也证实吴茱萸汤治疗后脑干中5-HT 的浓度会明显升高[3]，推测其可能通过抑制5-HT 重摄取而发挥治疗作用。值得注意的是，KEGG 通路富集分析得到肾素分泌通路与偏头痛的治疗相关，肾素可催化血管紧张素合成，从而产生收缩血管的作用。实验显示肾素-血管紧张素系统参与与偏头痛发病有关的神经源性炎症、内皮功能障碍和伤害性传导的神经调节，使用肾素抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂等有助于治疗偏头痛，临床中可用来预防偏头痛的发作[30-31]。

在交集靶点的PPI 网络中，VEGFA 与15 种成分、46 个靶点相互作用，是偏头痛治疗的一个核心枢纽靶点。研究发现，偏头痛患者发作期循环血中VEGFA 的含量较对照组明显降低[32]，VEGFA 对内皮细胞具有保护作用，涉及血管生成、血管通透性改变等因素，其在偏头痛发作过程中会导致内皮功能障碍和心血管疾病风险的增加，同时血管通透性的改变也会引起血浆外渗，激活三叉神经等感觉神经元细胞，从而产生疼痛和痛觉敏化。

利用分子对接对3 个关键靶点和吴茱萸汤活性成分进行分子对接，结果发现3 个靶点与多个成分之间结合良好，说明吴茱萸汤中成分作用于这些靶点发挥治疗偏头痛的作用。研究发现，与PTGS2 结合较好的多个成分如6-羟基木犀草素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素等均属于黄酮类化合物，大量研究发现，黄酮类成分可通过COX 途径，抑制COX-2的表达[33]。与SLC6A4 结合较好的成分包括喹诺酮碱和吲哚类生物碱，虽然网络药理学分析未发现吴茱萸碱与SLC6A4 的关系，本课题组发现升高吴茱萸汤中吴茱萸碱的含量能有效增加脑干5-HT 含量并改善偏头痛[34]，推测其发挥治疗作用的成分有可能与其代谢产物有关。与TRPV1 结合的成分主要是吲哚类生物碱，其中吴茱萸碱能有效抑制TRPV1 的激活[35]，具有明显的抑制神经病理性疼痛的作用[36]。

网络药理学的分析中，人参中含量较大的皂苷类成分与关键靶点的作用较少，吴茱萸汤临床应用中人参用量比例较大（10～15 g）[37]，表明人参在吴茱萸汤治疗疾病过程中发挥了重要的作用，大量研究发现，人参皂苷具有抑制COX-2 等炎症因子表达的作用[38]，但是皂苷类成分具有肠道内难以吸收、生物利用度低、肠内滞留时间较长的特点，经肠道菌群代谢后可产生大量的去糖基化代谢产物[39]，这些代谢物具有多种药理作用，如抗炎、抗糖尿病、抗过敏以及神经保护等[40]。本课题组研究发现吴茱萸汤中人参皂苷Rb1的含量与治疗偏头痛疗效呈正相关，与脑干中的分布呈负相关，因此推测人参中原型成分的作用靶点可能在脑外及肠道。这也提示网络药理学研究基于可吸收成分进行，对分析中药难吸收的成分可能发挥的作用存在一定的局限性。

综上所述，通过动物实验和网络药理学研究分析，发现吴茱萸汤治疗偏头痛可能是通过多种成分，作用于PTGS2、SLC6A4、TRPV1 等靶点，抑制神经源性炎症并调节5-HT 能信号通路实现的，表明网络药理学能较好地体现中药治疗疾病的特色，也为未来中医药研究提供了方向。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突