练启仙, 刘健锋, 杨茂发*, 罗 亭, 周小芸, 吴 广

(1.贵州大学， 贵州 贵阳 550025； 2.兴义民族师范学院， 贵州 兴义 562400)

0 引言

【研究意义】大青叶蝉Cicadellaviridis分布范围广，国外主要在日本、东南亚、印度以及欧洲等国家发生危害，我国北自黑龙江，南至海南，东自江苏、山东，西至西藏、新疆均有分布[1]。该害虫可危害禾谷类农作物、果蔬等160余种植物[1]。大青叶蝉主要是以成虫和若虫危害叶片，刺吸汁液，造成褪色、畸形、卷缩，甚至全叶枯死[2]，同时大青叶蝉还可传播植物病原菌[2-4]，是危害果树及林木的大敌。经研究，昆虫体内具有内共生菌，同时内共生菌可用于害虫防治以及降低昆虫传播病毒的能力[5]，因此探明大青叶蝉体内共生菌的分布，对利用调控体内共生菌以控制该害虫、减少虫传植物病毒病、化学农药对环境的污染和天敌等有益生物的伤害具有重要意义。【前人研究进展】内共生菌广泛分布于昆虫中，内共生菌能影响宿主所需的氨基酸等营养物质[6-8]，使雄虫雌性化[9-10]，影响宿主的生长与繁殖[11]。但共生菌在不同种类昆虫体内的分布部位存在差异。如油橄榄实蝇幼虫中，共生菌存在于中肠胃盲囊中[12]；内共生菌存在于菌胞体内的昆虫有药材甲和烟草甲[13]；NODA等[14]在飞虱的脂肪体中发现了类酵母菌；沃尔巴克氏体(Wolbachia)主要分布于昆虫生殖器官中[15]。【研究切入点】目前，已在大青叶蝉中检测到了内共生菌Sulciamuelleri[16-18]、Sodalissp.[17-18]和立克次氏体(Rickettsiasp.)[19]，但关于Sulciamuelleri、Sodalissp.在大青叶蝉中的分布及对其生长发育的影响尚未见报道。【拟解决的关键问题】通过用特异引物和PCR技术研究大青叶蝉体内共生菌的分布及其拷贝数，为利用内共生菌对大青叶蝉进行生物防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试虫源 大青叶蝉发生期，于贵阳市花溪区杂草地随机采集大青叶蝉成虫(雌、雄)，在室内利用水稻苗饲养产卵，卵孵化为若虫，成长为成虫，期间收集卵、1～5龄若虫和雌雄成虫供试验用。

1.1.2 引物与探针 用Primer 5设计Sulciamuelleri和Sodalissp.的16S rDNA序列的特异引物和TaqMan探针，由上海生物生工公司合成。

引物序列：SulendCV-F，5′-GTAGCGGTGAAATGCGTAGAT-3′；SulendCV-R，5′-TTCAACCTTGCGGTCGTACT-3′；SodendCV-F，5′-AAAGGAGACTGCCGGTGATAA-3′；SodendCV-R，5′-GGACTACGACGCACTTTATGAGA-3′[20-21]。

探针序列：SulendCV-P，5′-CCAATAGCGAAAGCAAGTTACTAAGCCT-3′；SodendCV-P，5′-CATGATGACTTGACGTCATCCCTACCT-3′[20-21]。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及PCR扩增 将保存于-20℃的不同虫态的大青叶蝉清洗干净后放在1.5 mL的无菌离心管中磨碎，然后根据QIAGEN试剂盒说明书的步骤提取样品DNA，并用特异引物进行PCR扩增。反应体系总体积为25 μL，其中包括含Mg2+的10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 18 μL。PCR的反应程序：预变性95℃ 3 min，变性94℃ 30 s，退火57℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，循环35个，最后延伸72℃ 10 min。完成扩增后进行凝胶电泳检测。

1.2.2 标准质粒的提取与测序 PCR纯化产物与pMD®18-T载体相连接后将其转到感受态细胞中(Trans1-T2)，涂板后培养过夜(37℃)，而后选取单个菌落置于含有浓度为50 μg/mL的Amp LB培养基中(5 μL)，振荡培养10 h(37℃)，最后利用Easy Pure® Plasmid MiniPrep Kit对阳性克隆子进行质粒的提取，质粒送上海生物生工公司测序。

1.2.3 绝对定量PCR 利用绝对定量PCR(TaqMan探针法)检测其样品DNA，反应体系总体积为20 μL，其中10 μL TransStart®Probe qPCR Super Mix，引物(10 μmol/L)各0.4 μL，荧光探针0.4 μL， ddH2O6.8 μL， DNA模板2 μL。反应程序：94℃预变性3 min，94℃变性5 s，57℃退火15 s，72℃延伸30 s，40个循环。添加样品后，置于Light Cycler480 Software Setup (Roche)中反应。

1.2.4 大青叶蝉不同发育历期的内共生菌感染率检测 在室内用水稻苗饲养大青叶蝉，获得大青叶蝉的卵、若虫、雌雄成虫，清洗干净后按照QIAGEN试剂盒说明书提取其DNA，然后用特异引物检测卵、1～5龄若虫、雌雄成虫的内共生菌感染率，分别检测10头，检测2代。

1.2.5 大青叶蝉不同发育历期的内共生菌拷贝数的检测 按照QIAGEN试剂盒说明书提取大青叶蝉卵、1～5龄若虫、雌雄成虫各发育历期的DNA，然后用绝对定量PCR对其内共生菌的拷贝数进行检测。

1.2.6 大青叶蝉组织器官的内共生菌拷贝数的检测 利用乙酸乙酯立即杀死大青叶蝉成虫后用酒精(75%)和无菌水清洗干净，然后置于无菌且有0.9%氯化钠溶液的凹玻片上，体视镜下解剖出菌胞体、卵巢、精巢、肠、唾液腺，每种组织器官取3个样品，每个样品来自解剖3头大青叶蝉，用PBS清洗后提取DNA。然后检测样品中S.muelleri和Sodalissp.的16S rDNA的拷贝数。

2 结果与分析

2.1 大青叶蝉不同发育历期的内共生菌感染率

经检测，在2代大青叶蝉的卵、1～5龄若虫和成虫各发育期均检测到S.muelleri和Sodalissp.内共生菌，且感染率为100%。

2.2 大青叶蝉不同发育历期的内共生菌拷贝数

如图1所示，S.muelleri内共生菌拷贝数在大青叶蝉5龄若虫中最高，而Sodalissp.内共生菌拷贝数在雌成虫中最高，S.muelleri和Sodalissp的拷贝数在卵中最少。从卵到5龄若虫，S.muelleri和Sodalissp.的拷贝数除在3龄若虫阶段有所下降外，其余阶段随着发育历期的增加而增高。

图1 大青叶蝉不同发育历期S. muelleri和Sodalis sp. 的拷贝数

2.3 大青叶蝉不同组织器官的内共生菌拷贝数

由表1可见，在大青叶蝉的卵巢、精巢、中肠、唾液腺、菌胞体中均检测出S.muelleri和Sodalissp.，然而在不同的组织器官中其数量又存在差异。在菌胞体中S.muelleri和Sodalissp.的拷贝数均较高，但在雄虫的肠及雌雄成虫的唾液腺当中却较少。

表1 大青叶蝉不同组织器官的内共生菌拷贝数

3 讨论

大部分的昆虫体内含有内共生菌，且存在于昆虫的各个发育历期和组织器官。WANGKEEREE等[22]在检测不同生长阶段的网脉融茎叶蝉和其各组织器官，其内共生菌BAMH存在于各发育期及其组织器官当中；廖珊等[23]试验证实，在灰飞虱的生殖器官、消化道等中具有沃尔巴克氏体(Wolbachia)；陈吉强等[24]在烟粉虱MEAM1隐种的卵、若虫和成虫中检测到CandidatusHamiltonella defensa、CandidatusProtiera aleyrodidarum和立克次氏体(Ricketsiasp.)3种内共生菌，同时立克次氏体还存在于菌胞体以及一些器官中。NODA等[11]发现，内共生菌S.muelleri存在于黑尾叶蝉的菌胞及卵巢当中。该研究结果与前人研究一致，大青叶蝉的卵、若虫、雌雄成虫均感染了S.muelleri和Sodalissp，此外在菌胞体、卵巢、精巢、中肠、唾液腺中均检测到2种内共生菌，说明2种内共生菌能通过大青叶蝉的雌虫完成垂直传播。

不同昆虫体内的共生菌，其作用有所不同，如蛴螬后肠中细菌群落，能为蛴螬提供必需的甾醇类物质；种蝇(Hylemya)幼虫的消化道内的细菌能产生维生素B及其他重要的营养物质，使幼虫发育加快；蜡螟体内共生菌能促进蜡的消化；白蚁消化道中的细菌能固定大气中的氮，并为昆虫的组织吸收利用[13]。甘蔗长蝽体内的伯克霍尔德氏菌具有降解农药的作用[25]；立克次氏体可以提高烟粉虱各龄期的存活率、延长其成虫寿命[26]；Cardinium可增加烟粉虱的雌性比例[27]。大青叶蝉体内的共生菌S.muelleri可合成宿主需要的氨基酸[28]，然而Sodalissp.对宿主的作用还需进一步研究。

大青叶蝉的不同发育历期及不同器官和组织所携带的S.muelleri、Sodalissp.内共生菌的拷贝数不同，从卵到2龄其内共生菌S.muelleri、Sodalissp.的拷贝数呈上升趋势，然而在3龄时降低，从4龄开始又增加，2种内共生菌在菌胞体中的含量最多，其次是雌雄生殖器官，说明S.muelleri、Sodalissp.内共生菌在大青叶蝉体内有一定的动态变化规律。为进一步研究内共生菌与寄主之间的相互关系和利用内共生菌对大青叶蝉进行生物防治提供参考。

4 结论

大青叶蝉体内和不同组织及器官(菌胞体、卵巢、精巢、中肠、唾液腺)中均检测到S.muelleri和Sodalissp.内共生菌，S.muelleri内共生菌在5龄若虫中拷贝数最高，Sodalissp.内共生菌在雌虫中最多，2种内共生菌在卵中均最少；2种内共生菌均在菌胞体中的拷贝数最高，在雄虫的肠、雌雄唾液腺当中却很少。