＊吴春凯 王冲 孙国振 李良霄 袁考哲

（滨州医学院 山东 264003）

据查询国外研究资料显示，1987年至1989年期间，生物医学研究者在培养器皿中培养上皮细胞生产t-PA时，通过添加不同浓度的丁酸钠，获得不同产率的t-PA，但是浓度的添加存在一定阈值。之后，生物医学研究者在研究丁酸钠处理重组CHO细胞生长时，得出丁酸钠的存在可以提高腺病毒晚期启动子与重组Ⅷ因子mRNA的转录。通过丁酸钠浓度的含量减慢细胞培养分裂的周期，提高细胞分泌的产物。重组CHO细胞的产物红细胞生成素（rhEPO），而且在糖末端连接一定的唾液酸，该物质的含量程度能够提高rhEPO的活性因数[1]。rhEPO的普遍应用在临床上治疗肾性贫血类疾病与恶性肿瘤贫血类疾病，而且促红细胞生成素的产生目前阶段仅通过重组CHO细胞表达。故此，研究重组CHO细胞与rhEPO表达量的重要性不言而喻。

现阶段，丁酸盐类物质通常在肠道内形成，并存储于动物的脂肪之中。虽然丁酸盐在动物体内的浓度不高，但是其拥有的生物学活性却不容小觑。例如，在动物细胞培养阶段，通过加入一定含量的丁酸盐或丁酸钠，将会为细胞的培养带来不可思议的可逆形态变化。部分生理变化由内部基因的表达和细胞生长发育的调节机理所决定。根据临床细胞的培养，丁酸钠能够借助自身性质同时激活多种途径诱发细胞G1期阻滞，比如抑制组蛋白去乙酰化酶的基本活性因数、蛋白激酶抑制蛋白活性因数等。前面提及到在细胞培养阶段，通过添加适量的丁酸钠可以有效提高重组CHO细胞生长与rhEPO表达水平，同时因丁酸钠对细胞生长繁殖的抑制作用是可逆的，也就是意味着撤去丁酸钠物质时，细胞的活性又会与早期阶段表达水平一致[2]。基于以上对丁酸钠和rhEPO表达的描述，本文通过对照实验的研究方式，培养重组CHO细胞生长，并采用不同浓度的丁酸钠作出处理，以此检测rhEPO表达水平，目的在于探究丁酸钠在工程细胞株的活性影响，继而得出提升重组CHO细胞产物rhEPO表达水平的方案，为后续的大规模临床研究奠定基础，现以丁酸钠对CHO细胞生长及rhEPO表达量的实验回顾性分析如下。

1.材料与方法

(1)实验材料

本次研究过程的实验材料选择为：①重组蛋白CHO细胞是由本实验室构建与保存；②能够培养细胞的血清培养皿DMEM/F12是购置于国外的Hyclone公司；③需要添加的10%胎牛血清是购置于国外的一家Bioind（BI）公司，胰酶是购置于国外的一家Gibco公司；④无血清培养基选定为SFM。

(2)细胞培养

表达rhEPO的重组蛋白CHO细胞在培养阶段，需采用24孔板培养，并保证研究组与对照组的细胞接种数含量一致，即每个孔板接种60000个细胞数目。同时，研究组与对照组的重组蛋白CHO细胞需放置于37℃、5%二氧化碳浓度以及适宜的湿度环境下作出精密培养。两组细胞培养首先使用添加了含有10%的血清培养皿DMEM进行培养，之后等到细胞培育铺满后，依次获取上层培养液。对照组细胞培养时需使用SFM无血清培养皿进行培养，而研究组细胞需将SFM无血清培养皿更换为含有0.25mmol/L、0.5mmol/L、0.75mmol/L的丁酸钠浓度的培养皿，每一个丁酸钠浓度设置三个复孔位，其他条件应该严格保持一致。整个细胞的培养过程中，需要注意隔一天换一次培养液，继续收集培养液的上层清液，同时使用血球计数板计数细胞密度，计算出相应的细胞生长曲线以及使用6块24孔板，保持实验周期在20天。另外，实验细胞样本的存放需要放置于-80℃的环境中，并用于促红细胞生成素表达水平的检测[3]。

(3)检测方法

①细胞计数。细胞计数需借助专业仪器，即血球计数板或者CASY细胞计数仪设备，以此保证细胞计数的准确性，同时使用台盼蓝拒染法测定细胞的存活率。

②细胞纯化与纯度检测。细胞计数后需要作出纯化处理，即采用国外某公司的PF设备，将每一次收起的培养液上层清液进行三次纯化操作（亲和环节、离子交换环节、凝胶过滤环节）。完成了细胞纯化操作步骤后，需要在SDS-PAGE电泳设备的帮助下，检测样本的纯度数据，即浓缩胶的浓度系数维持在4.5%左右，分离胶的浓度系数维持在12.5%左右[4]。

③细胞表达量的测定。在重组蛋白CHO的rhEPO表达量的测定上，可以借助目前较为先进的DOTBLOT测定方法，该测定方法在前人的基础上作出相应的改进，将纯化后的洗脱液含量提取5μL放置于杂交膜上，并采用偶联有辣根过氧化物酶抗EPO抗体作为一抗，继而执行DOTBLOT检测方案。经过显影曝光测定过程，以标准品阳性信号的强弱梯度作为测定标准，以此计算出样品中rhEPO表达量的水平。除此之外，在唾液酸含量的检测上需借助间苯二酚法予以测定[5]。

2.结果

（1）分析丁酸钠的添加含量对重组CHO细胞生长的影响。据实验结果显示，细胞计数与细胞存活量数据，丁酸钠的添加含量在对重组蛋白CHO细胞的抑制作用效果越强。根据实验数据显示，丁酸钠的添加含量对重组CHO细胞生长的形态存在一定的影响，比如对照组细胞的形状呈现出一种多层次的生长状态，且大部门的细胞以圆形为主；研究组细胞的形状呈现出一种簇状的生长趋势，且培养浓度越高的培养皿内细胞簇越小，以长梭状为主。丁酸钠的添加含量对重组CHO细胞生长的影响，见图1所示。

图1 丁酸钠的添加含量对重组CHO细胞生长的影响

（2）分析丁酸钠的添加含量对产物细胞rhEPO表达的影响。据实现数据显示，在0.25mmol/L至0.5mmol/L的丁酸钠浓度范围内，丁酸钠的浓度高低决定了重组蛋白CHO细胞产物rhEPO表达的水平，且丁酸钠浓度越高rhEPO表达的水平则越高，同时伴随着培养时间的延续，单位时间内的单位细胞rhEPO表达水平呈现上升的趋势，与浓度的高低存在正比例关系。

（3）分析丁酸钠的添加含量对葡萄糖代谢的影响。据实验研究数据显示，丁酸钠的添加能够对重组蛋白CHO细胞的糖代谢产生抑制作用，且与浓度含量多少的存在一定影响。在加入丁酸钠后，研究组重组CHO细胞的平均比葡萄糖损耗速率与对照组的8×10-9mmol/L降低至6×10-9mmol/L。造成此类影响的原因在于葡萄糖进入细胞后的代谢途径相关。在对照组重组CHO细胞的培养阶段，因不含有丁酸钠物质，细胞会处于不断生长与分裂过程中，葡萄糖物质的应用除了供细胞自身所需以及rhEPO表达量之外，还用于细胞物质的大量合成。丁酸钠的添加含量对葡萄糖代谢的影响，见图2所示。

图2 丁酸钠的添加含量对葡萄糖代谢的影响

（4）分析丁酸钠的添加含量对重组CHO细胞表达量的影响。据实验研究数据显示，研究组细胞在培养时间的延长后其rhEPO表达量呈现增长的趋势，对照组细胞的rhEPO表达量在一定培养时间过程呈现降低趋势。0.25mmol/L的丁酸钠浓度在添加的第四天后，其rhEPO表达量便已经超过对照组的细胞rhEPO表达量。随着丁酸钠浓度的逐渐提高，对CHO细胞的抑制作用越来越强，以至于rhEPO表达量经过一段时间后才会超过对照组rhEPO表达量。故此，通过0.25mmol/L与0.5mmol/L的丁酸钠浓度的添加，获取的rhEPO表达量分别提升了36%与25.8%。另外，随着培养的时间逐渐延长，产生的rhEPO表达量则会越高。

3.讨论

据本次研究报告指出，研究组重组蛋白CHO细胞的培养阶段，添加不同浓度的丁酸钠，可以有效的抑制细胞的生长，但对于短期内的rhEPO表达水平提升效果不佳。故此，在细胞的生长周期中如若获取rhEPO表达量可以在培养的中后期添加一定含量的丁酸钠浓度，适当的延长细胞的生长周期，以便得到更多的rhEPO表达量。另外，丁酸钠的添加可能会影响蛋白糖基化，导致唾液酸含量和寡糖链位点占有率降低，此处的研究还需进一步验证。希望本文在丁酸钠对CHO细胞生长及rhEPO表达量影响的研究，可以为同领域的学者提供借鉴价值。