许 娜，刘馨璐，汤 蓉，张 曦，李 莉，李大鹏

(华中农业大学水产学院，池塘健康养殖湖北省工程试验室，长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心，武汉430070)

在有限的水体空间内使养殖鱼类生长的更快更好，是水产养殖业普遍追求的目标。目前许多研究关注日粮、养殖密度、流速等因子对养殖鱼类生长的影响[1-3]，以期指导鱼类生产，从而达到促进鱼类健康快速生长的目的。鱼类普遍存在逆水流游泳的生理现象，在鱼类的生命活动过程中，水流速度是一个重要的环境影响因子。研究表明，适当的水流速度(0.75～2 bl/s)会对鱼类的摄食、生长、新陈代谢等生命活动产生积极的影响[1，4，5]等。进一步的研究证实，运动训练促进鱼体生长可能与多种因素有关，例如食物转换效率、甲状腺激素(THs)以及生长激素(GH)等[6]，然而相关机制尚不清楚。

THs包括甲状腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)[7]。THs在机体代谢生理过程发挥重要作用，并且是调节生长的关键因子[8,9]。在鱼类中，THs的分泌由下丘脑-垂体-甲状腺(HPT)轴调节，垂体前叶释放的促甲状腺激素(TSH)经血液运输至甲状腺滤泡，刺激其合成释放THs到血液中以发挥作用[10-12]。研究发现，哺乳动物在运动后，血清T4和T3浓度显著降低[13-14]。而鱼类在不同流速的运动训练后，血清T3显著升高[15-16]。运动训练调控动物体内THs的代谢可能是通过影响其合成、转化和转运等过程。硬骨鱼甲状腺滤泡主要合成分泌T4，而T3主要是在外周组织中，通过脱碘酶(IDs)去除T4外环上的碘转化而来[17-18]。T3是机体中发挥生物活性的主要THs形式，通过与血清中的甲状腺激素转运蛋白(TTR)结合运输至靶组织器官，与甲状腺激素受体(TR)结合，进而发挥其生物学效应，影响机体的生殖、生长、发育等过程[19-20]。在血液中，大部分T3和T4与转运蛋白结合，形成结合态的THs，少部分T3和T4不与转运蛋白结合，呈游离态THs(FT3和FT4)[21]。两种状态的THs之间可以相互转化，以保持机体中THs的稳态[22]。

草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是我国最主要的淡水养殖鱼类。据2020年中国渔业统计年鉴[23]报道，草鱼的养殖总产量在2019年已超过553万吨，位居我国鱼类养殖产量第一。目前，流道养殖、工厂化循环水养殖模式通过创造水流或环流环境，诱导鱼类进行逆流游泳，但多大流速的运动训练对草鱼的促生长效应最为显著，不同强度的运动训练对草鱼甲状腺生理代谢有何影响尚未见报道。本试验采用封闭循环水养殖系统，通过对草鱼幼鱼进行不同水流刺激的长期运动训练，探讨其对草鱼幼鱼生长和甲状腺激素代谢的影响，旨在确定草鱼适宜流速范围，为草鱼流道养殖模式提供基础科学数据和指导。

1 材料和方法

1.1 试验鱼与试验设计

本试验以健康草鱼幼鱼为试验对象，试验鱼购自湖北省黄冈市团风县百容良种场。试验前置于华中农业大学水产学院基地循环水养殖系统中暂养。

试验采用自行设计的环流水养殖装置(图1)。在内径1 m，水深80 cm的圆形养殖缸内部中央放置一直径25 cm，高80 cm的PVC管。养殖缸右侧用吸盘吸附一可调节水流量的潜水泵，潜水泵出水口安装PVC直通管(长50 cm)，侧面同一直线上钻孔出水(8～12个)。试验装置通电后，依据不同功率(25 W、100 W和150 W;型号 HJ-1500HJ-5500HJ-6000,森森集团股份有限公司)的潜水泵造成不同水流速度的训练环境。

图1 环流水养殖系统设计图

将初始体重和体长分别为(97.68±3.26) g和(18.18±0.13) cm的168尾健康草鱼幼鱼随机分为静水对照组(0 bl/s)和运动训练组(0.5、1.0和1.5 bl/s)，每组3个平行养殖缸，每缸14尾鱼。为了减少应激，在正式试验前3 d，逐步增加训练时间，直至达到正式训练时长16 h/d(17:00～9:00)。试验历时为10周，每2周测定一次试验鱼的体长体重，根据体长的平均值调节至试验相对应的流速，利用LS300-A型便携式流速测算仪(南京卓玛机电有限公司)测定流速大小。按照草鱼幼鱼体重的3%投喂饲料[24]，每天投喂2次(9:00和16:00)，投喂期间各组水环境均保持静水状态。试验期间水温为(25.56±0.36) ℃，pH为8.06±0.02，溶氧保持在6.0 mg/L以上。

1.2 样品采集

试验10周，当天训练结束后进行采样。每缸随机选择9尾鱼，MS-222(200 mg/L)麻醉后用注射器自尾静脉取血2～3 mL，3 000 r/min离心20 min，取上层血清，保存于-80 ℃下用于激素测定。取肝脏样品用冻存管迅速放入液氮速冻，保存于-80 ℃超低温冰箱用于脱碘酶和基因检测。

1.3 血清皮质醇测定

采用放射性免疫测定法测定血清皮质醇含量，使用皮质醇放射性免疫试剂盒(北京北方生物技术有限公司，批号20191019)进行测定。具体方法参考文献[17]。

1.4 血清葡萄糖测定

葡萄糖(GLU)试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司(批号193681)，在Selectra XL型全自动生化分析仪(荷兰威图科学公司)上测定。

1.5 血清甲状腺激素与促甲状腺激素含量的测定

血清甲状腺激素(T3、T4、FT3和FT4)和促甲状腺激素(TSH)含量采用酶联免疫(ELISA)检测试剂盒(北京北方生物技术研究所，批号依次为201907001、201907001、201909001、201908001和201907001)测定。

1.6 脱碘酶含量的测定

脱碘酶(ID1、ID2和ID3)含量采用酶联免疫(ELISA)检测试剂盒(上海酶联生物科技，批号202007)测定。用纯化的鱼脱碘酶(ID1、ID2和ID3)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入脱碘酶(ID1、ID2和ID3)，再与HRP标记的脱碘酶(ID1、ID2和ID3)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色,TMB在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的脱碘酶(ID1、ID2和ID3)呈正相关。用酶标仪在 450 nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中鱼脱碘酶(ID1、ID2和ID3)浓度。

1.7 实时荧光定量PCR

使用总RNA提取试剂(武汉科尔普生物科技有限公司，批号130318)提取肝脏总RNA；使用Hifair®Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR(gDNA digester plus)试剂盒(YEASEN，批号H0901221)进行逆转录；使用HieffTMqPCR SYBR®Green Master Mix(Low Rox Plus)试剂盒(YEASEN，批号H6004040)并在Quant Studio 6 Flex Real-Time PCR Detection System(Applied Biosystems,USA)上进行荧光定量反应。基因特异性引物序列(表1)参考本试验室已验证引物[17]。具体方法参考文献[25]。

1.8 数据及统计分析

所得数据以平均值±标准误表示，采用SPSS 21.0统计分析软件对试验数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan法多重比较分析，P<0.05认为差异有统计学意义。使用Graphpad Prism.v 6.0作图。

2 结果

2.1 草鱼幼鱼生长曲线

不同流速的训练下，草鱼幼鱼的体重增长趋势如图2所示。增长最快的是0.5 bl/s和1.0 bl/s训练试验组，其次是1.5 bl/s训练试验组，增长速度最慢的是0 bl/s对照组。

图2 不同流速下草鱼幼鱼的生长曲线

2.2 血清葡萄糖和皮质醇含量

草鱼幼鱼在不同水流刺激下运动训练10周后，各组血清中葡萄糖和皮质醇含量均保持稳定水平，并未观察到显著性变化(表2)。

表2 不同流速下草鱼幼鱼血清葡萄糖和皮质醇含量

2.3 血清THs含量和T3/T4比值

随着流速的增加，草鱼幼鱼血清T3和T4含量呈现下降趋势(图3)。与对照组相比，1.0 bl/s和1.5 bl/s试验组草鱼幼鱼血清T3含量显著降低，0.5 bl/s试验组降低不显著，而各试验组(0.5、1.0和1.5 bl/s)T4含量皆显著降低。10周的运动训练后未观察到血清FT3和FT4的显著变化(图3)。对各流速组的T3与T4的比值进行对比发现，试验组(0.5、1.0和1.5 bl/s)T3/T4显著高于对照组，分别增加14.00%、20.76%和18.12%(图4)。

图3 不同流速训练下的草鱼幼鱼血清THs含量

图4 不同流速下草鱼幼鱼血清T3/T4

2.4 血清TSH含量

10周的运动训练改变了草鱼幼鱼血清中TSH水平(图5)。0.5 bl/s试验组TSH水平和其他三组无显著性差异，而1.0 bl/s和1.5 bl/s试验组草鱼幼鱼血清TSH含量显著上升，分别是0 bl/s对照组的1.56和1.67倍。

图5 不同流速下草鱼幼鱼血清TSH含量

2.5 肝脏脱碘酶含量

与对照组相比，各试验组脱碘酶(ID1、ID2和ID3)含量皆为上升趋势(图6)。ID1在1.5 bl/s试验组草鱼幼鱼肝脏中含量最高，在0.5和1.0 bl/s试验组中次之，且两组间无显著性差异。试验鱼肝脏ID2含量随着流速的增加而增加，且各组之间皆有显著性差异。ID3含量在各组间未见显著性差异。

图6 不同流速下草鱼幼鱼肝脏中脱碘酶含量

2.6 甲状腺激素代谢相关基因表达量

1.0 bl/s和1.5 bl/s试验组草鱼幼鱼肝脏中ttrmRNA水平显著高于0 bl/s和0.5bl/s组，而0 bl/s和0.5 bl/s组间没有显著差异(图7)。试验组tr-α和tr-β基因表达量高于对照组，其中0.5 bl/s试验组tr-α表达水平和其他三组无显著差异(图7)。

图7 不同流速下草鱼幼鱼肝脏中ttr、tr-α和tr-β的基因相对表达

3 讨论

鱼类在发生应激反应时会激活下丘脑-垂体-肾间组织(HPI)轴，导致血清皮质醇的含量发生显著升高，进而增强机体糖异生作用来升高血糖，所以血清皮质醇和葡萄糖的含量变化可以被用来评估鱼类是否发生了应激反应[26-27]。鱼类在处于拥挤胁迫、亚硝酸盐胁迫和高强度运动训练时，机体会升高血清皮质醇和葡萄糖等血清生化指标[28-30]。运动训练时鱼类发生应激反应可能和运动训练的强度、时间等有关。如虞顺年等[31]研究发现，黑鲷(Sparusmacrocephalus)在适度运动训练(2 bl/s)后血清葡萄糖含量下降，而高强度运动训练(4 bl/s)显著升高血糖含量，说明较高的训练强度才引起鱼类应激。本试验中草鱼幼鱼在1.5 bl/s及以下流速皆未显示血清葡萄糖含量的显著变化，表明草鱼幼鱼能够适应1.5 bl/s及以下流速的运动强度。Nielsen等[32]发现虹鳟(Oncorhynchusmykiss)在游泳开始时，血浆皮质醇水平以运动依赖的方式增加，但在24 h内恢复到游泳前的水平，持续游泳对此没有明显的影响。与王海珊等[16]研究结果一致，本试验中草鱼幼鱼在经历不同流速的运动训练后，血清皮质醇含量也未发生显著性变化，说明长时间的运动训练导致草鱼幼鱼适应了运动的环境。Hernández等[33]发现，虹鳟在运动后，血浆皮质醇和葡萄糖浓度均明显升高，但经过训练后训练鱼的代谢反应能力提高，并减少了强迫运动的应激，能显著平衡这种升高现象。本试验草鱼幼鱼每天经历16 h的运动训练，持续70 d，最后未观察到血清皮质醇和葡萄糖含量的变化。试验结果表明草鱼幼鱼可以适应一定流速下的长期运动训练，不会发生生理应激以对生长产生不良影响。我们发现1.5 bl/s及以下的流速的运动训练对草鱼幼鱼的生长均有积极作用，训练后的草鱼具有更高的增重率、特定生长率和更低的饵料系数(数据未发表)，运动训练促进了草鱼幼鱼的生长和食物转化率。根据生长曲线发现，0.5～1.0 bl/s流速是促进草鱼幼鱼生长的最适流速。

THs的分泌受到HPT轴的调控[34]。鱼类垂体释放的TSH作用于甲状腺滤泡，使其合成释放T4到血液中进行转运、代谢等活动[35]。研究发现，微囊藻毒素处理会显著降低斑马鱼(Daniorerio)血清T4的浓度，同时导致肝脏tsh基因表达量的显著增加[36]。当机体血液中的T4含量发生显著降低时，一些硬骨鱼的HPT轴会发生负反馈调节，通过不同途径刺激T4的合成分泌增加，以维持体内T4水平的稳定[37]。本研究发现运动训练组草鱼幼鱼血清T4水平显著降低，可能触发对TSH的反馈调节而导致血清TSH含量显著升高。

在机体中，T3是一种具有生物活性的THs，主要是在脱碘酶的作用下，经过T4的外环脱碘作用转化而来[38]。ID1和ID2可以催化T4外环脱碘形成T3，其中ID2发挥主要作用，而ID3催化T3和T4的失活[39-41]。所以在鱼类中，ID2和ID3主要负责调节THs代谢中T3的生成和转化速度，即调控着THs的激活与失活，以维持体内THs代谢稳态。脱碘酶的活性可以间接反映机体外周组织内不同形式THs之间相互转化的代谢情况[10]。运动训练组草鱼幼鱼肝脏中ID1和ID2含量显著升高而ID3含量无显著差异，说明未发生T3和T4的大量失活，而是加快了T4向T3的转化速率，激活THs，促进机体代谢。研究发现，大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchustshawytscha)在游泳运动后血液T3/T4比值显著提高[15]。长期运动训练的草鱼幼鱼血清中T3/T4比值的增大说明T4向T3的转化增加，提高了THs活性形式的利用效率。

TTR主要负责结合与转运机体内THs，T3与其结合运输至外周组织中，通过与相关靶细胞的TR结合，进而发挥生物学效应[20,42]。甲状腺激素受体包含两种类型，即TR-α与TR-β[43]。Liu等[44]发现斑马鱼幼鱼暴露于微囊藻毒素后，全身T3含量发生显著性的降低，而ttrmRNA水平显著上调。王海珊等[16]发现异育银鲫“中科 3 号”在2 bl/s流速下游泳训练8周后，肝脏tr-α基因表达量显著上升，促进了与T3的结合，以发挥THs生物学效应。THs通过调控靶组织基因的表达来影响生理过程[45]。本试验中运动训练显著上调草鱼幼鱼肝脏ttr、tr-α和tr-βmRNA水平，促进了T3的结合转运和代谢，导致血清T3含量显著降低。运动训练导致T4和T3快速转化，更好地调控鱼类的生长发育等代谢活动。

经过10周的运动训练，草鱼幼鱼能够适应1.5 bl/s及以下的水流环境，不同流速影响机体THs的合成、转运和代谢各过程，造成了甲状腺激素水平的变化，进而调控鱼类相关代谢活动，最终促进了鱼体生长。生长曲线显示，0.5～1.0 bl/s的流速是促进草鱼幼鱼生长的最适流速，此时鱼体的生长速度最快。