张 曦，万 莹，席汝娟，沈志远，何 亚，李 莉，汤 蓉，李大鹏

(华中农业大学水产学院，水产养殖国家级实验教学示范中心，长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心，池塘健康养殖湖北省工程实验室，武汉 430070)

草鱼(Ctenopharyngodonidellus)隶属鲤形目鲤科草鱼属，是我国重要的淡水养殖经济鱼类，也是全球最大养殖产量的鱼类品种。随着社会文明的发展，人们对水产品质量安全和鱼肉品质的关注度越来越高。我国草鱼池塘养殖历史悠久，养殖方式多样，其中以投喂饲养方式为主，常见的草鱼池塘养殖模式有以种青喂草为主的种青养殖模式和投喂人工配合饲料的单一饲料养殖模式，不同养殖模式下草鱼肌肉品质的差异显著[1]。

目前对草鱼肌肉品质的研究多集中在营养成分、品质特性和肌纤维等方面[1-3]，但对于不同养殖模式下草鱼肌肉中胶原蛋白的相关研究还十分欠缺。胶原蛋白的含量和存在形态在维持肌肉结构、柔韧性、硬度等肌肉质构特性方面同样发挥着重要作用[4-6]。在草鱼的相关研究中发现，脆肉鲩中肌肉质地发生脆化的主要原因是肌肉中肌膜组织的加厚，胶原蛋白含量增多，胶原纤维排列更加紧密有序[7]。因此，胶原蛋白在草鱼肌肉品质的研究中具有重要意义，但目前相关研究较少。

目前已知的胶原蛋白类型共29种，在鱼类肌肉中存在的主要为I型胶原蛋白[8-9]。在调控I型胶原蛋白的合成过程中，TGF-β/smads(transforming growth factor-β/drosophila mothers against decapentaplegic proteins)信号通路起到至关重要的作用。TGF-β/smads通路主要调控相关细胞外基质合成基因的转录，其中TGF-β1能通过激活其下游smad4基因，调控I型胶原合成基因col1α1和col1α2的转录[9-11]。因此，草鱼胶原蛋白的形成可能受到以上多种相关基因的调控。

本实验开展了种青养殖模式下草鱼肌肉中胶原蛋白的相关研究，并与饲料养殖模式下草鱼肌肉进行了对比分析，探讨不同养殖模式下草鱼肌肉中胶原蛋白的分布、含量和相关基因的表达分析，为提升草鱼肌肉品质和健康养殖模式提供理论基础和数据支持。

1 材料和方法

1.1 实验材料

种青养殖模式的草鱼(青饲料为黑麦草、小米草和苏丹草)和饲料养殖模式的草鱼(饲料来源为通威饲料有限公司)来自于湖北洪湖大同池塘养殖区，鱼体平均重量(820±50) g，平均体长(40±2) cm，均无显著性差异，随机挑选健康草鱼5尾进行实验。

1.2 实验方法

1.2.1 组织学观察实验

草鱼急杀后，将背部肌肉按照肌肉纹理各取约(1 cm×1 cm×1 cm)大小的肌肉，在磷酸盐缓冲液中洗去血污，放入4%多聚甲醛固定液中进行固定；采用组织学石蜡切片技术进行组织块横切面连续切片；本实验采用Masson染色方法染色切片；使用Nikon Eclipse 80i显微镜下对肌肉切片进行拍照观察，观察肌纤维及结缔组织，并采用NIS-Elements软件测量肌纤维面积和直径。

1.2.2 透射电镜肌膜胶原纤维观察

取草鱼背部肌肉按肌肉的纹理规格整齐、小于3 mm3的肌肉小块，一分钟之内迅速放入装有1 mL 2.5%戊二醛的电镜固定液的2 mL离心管中，置于4 ℃冰箱内保存。送样于华中农业大学电镜平台，重新转入新的装有2.5%戊二醛的1.5 mL离心管中，标注好编号。生物样品制片的前处理方法参照林如辉等[12]的方法，使用H-7650(日立)透射电镜观察。

1.2.3 胶原蛋白含量测定

采集草鱼背肌样品用保鲜膜封存于-20 ℃的冰箱内，称重后置于冷冻干燥机中冷冻干燥，准确称取于水解管内，加入6 mol/L HCl抽真空后充入高纯氮气，将水解管置于110 ℃干燥箱内水解22 h后，取出。真空干燥后蒸干，然后加入0.02 mol/L柠檬酸钠缓冲液1 mL，高速离心过滤后上机。使用835-50型氨基酸自动分析仪(日立)测定羟脯氨酸含量，并计算胶原蛋白含量。

胶原蛋白含量=羟脯氨酸含量×100/11×100%[13]。

1.2.4 胶原蛋白相关基因表达

使用Trizol试剂法提取两种养殖模式下草鱼肌肉的总RNA，检测质量并测定纯度后，使用TaKaRa反转录试剂盒合成cDNA。合成cDNA时RNA模板的统一加入量为1 000 ng,采用Prime Script RTreagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反转录试剂盒，按照说明书方法进行cDNA合成。

根据GenBank中已有的col1α1、col1α2、TGF-β1和smad4序列，用Primer5.0软件设计特异性引物。荧光定量PCR以β-actin为内参基因，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。

表1 草鱼基因定量的引物序列

以cDNA为模板，分别采用相应基因的引物进行实时荧光定量PCR。采用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(YEASEN,Shanghai,China)试剂盒， 按照说明书进行荧光定量实验。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃延伸10 min。

1.2.5 数据统计及分析

所得数据以平均值±标准误差表示，用Graphpad Prism 7.00作图。草鱼基因相对表达水平采用2-ΔΔCt法计算。采用SPSS 18.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan's法多重比较分析。当P<0.05时，差异显著；当P<0.01时，差异极显著。

2 结果

2.1 肌肉的组织学观察

由图1中可以清楚地观察到肌纤维和肌膜结缔组织的分布，Masson染色后肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色，胶原纤维是肌膜结缔组织的最主要组成部分。种青养殖模式下草鱼肌肉与饲料养殖模式下的草鱼相比，肌膜结缔组织更厚，其胶原纤维更多。在肌纤维的观察中，由图1和图2可知，种青养殖模式下草鱼肌肉的肌纤维直径和面积均小于饲料养殖模式下的草鱼肌肉，且存在极显著差异。

图1 草鱼肌肉的组织学结构(横切，×100)

图2 草鱼肌肉肌纤维直径和面积

2.2 肌膜胶原纤维观察

由图3中可清晰地观察肌膜中胶原纤维的分布。种青养殖模式下的草鱼肌膜中的胶原纤维成密集的束状，排列整齐紧密，无间隙且周围组织紧密(图A)；而饲料养殖模式下的肌膜中的胶原蛋白纤维成疏松的束状，排列不紧密，有明显间隙，周围组织分散(图B)。

图3 草鱼肌肉肌膜上的胶原蛋白纤维结构(纵切，×20000)

2.3 肌肉中的胶原蛋白含量

表2所示为两种养殖模式下草鱼肌肉中羟脯氨酸含量及胶原蛋白含量。种青养殖模式下草鱼肌肉中胶原蛋白含量高于饲料养殖下的草鱼肌肉，并且经过统计学分析其含量有极显著差异。

表2 草鱼肌肉中羟脯氨酸及胶原蛋白的含量

2.4 草鱼肌肉中胶原蛋白相关基因的表达

两种养殖模式下草鱼肌肉中均检测到col1α1、col1α2、TGF-β1和smad4的mRNA表达，种青养殖模式下草鱼肌肉中I型胶原蛋白相关基因的mRNA相对表达量均高于饲料养殖模式下的草鱼肌肉(图4)。其中，col1α1、col1α2和smad4的mRNA表达有极显著差异。

图4 草鱼肌肉中col1α1、col1α2、TGF-β1和smad4基因的mRNA相对表达量

3 讨论

肌肉中胶原蛋白的含量和存在形态会对肌膜结缔组织的密度和硬度造成直接影响，从而改变肌肉的相关特性，其含量和性质在很大程度上影响肉品的感官及加工品质[6,7,14]。本实验研究结果表明，种青养殖模式下草鱼肌肉中胶原纤维分布、胶原蛋白含量及相关基因表达量均高于饲料养殖模式下的草鱼肌肉。在肌肉组织切片观察中发现，种青养鱼模式下草鱼肌肉的肌纤维直径和面积小于饲料养殖模式下的草鱼肌肉。在鲈鱼(DicentrarchuslabraxL.)的研究中发现，野生鲈鱼的肌纤维直径比养殖鲈鱼的肌纤维直径更小，并且这可能与野生鲈鱼更强的肌肉质构性能如肌肉硬度等直接相关[15]。同时，肌纤维直径与肌肉胶原蛋白含量密切相关，直径较小的肌纤维通常具有较高的胶原蛋白含量[2,6]。本研究中也获得类似结果，种青养殖草鱼的肌纤维直径更小，其胶原蛋白含量更高。另一方面，本研究中发现种青养殖模式下的草鱼肌膜结缔组织较粗。肌膜结缔组织的主要组成成分为胶原蛋白，肌肉中结缔组织与肌肉的质构性能密切相关[16-17]。在脆肉鲩的研究中发现，肌肉中结缔组织的增厚和胶原蛋白含量的增多是其质构性能增强的重要原因[7,18]。在鲤鱼(Cyprinuscarpio)、角鲨(Squaluscubensis)的研究中发现，随着胶原蛋白含量的增加，肌肉质地硬度增强[8]。同时，本研究对草鱼肌肉肌膜中的胶原蛋白纤维进行了电镜观察，发现种青养殖模式下的草鱼比饲料养殖模式下的草鱼肌膜中的胶原蛋白纤维更多、排列更紧密有序。这也为种青养殖模式下草鱼肌肉质构性能的提升提供了一定的理论依据[2]。

胶原蛋白的合成受到相关基因的调控，本研究中发现种青养殖模式下草鱼肌肉中I型胶原蛋白相关基因col1α1、col1α2和smad4的mRNA表达均显著高于饲料养殖模式下草鱼。在TGF-β/smads通路中TGF-β1能通过激活其下游smad4，调控I型胶原合成基因col1α1、col1α2的转录[10-11]。在col1α1和col1α2表达后会形成相应的多肽链α1链和α2链，两条α1链和一条α2链共同形成具有三股螺旋立体构造的I型胶原蛋白。因此，种青养殖模式提升胶原蛋白含量的作用机制可能通过TGF-β1/smad4通路诱导col1α1和col1α2的表达上调从而增加肽链α1链和α2链的生成。因此，种青养殖模式可提升草鱼肌肉中I型胶原蛋白相关基因的表达，从而提升胶原蛋白的含量，这也与本实验中种青养殖模式下草鱼胶原蛋白含量更高的结果一致。I型胶原蛋白具有独特的三重螺旋构造，并在适宜的条件下有序排列形成胶原纤维，在前期研究中发现在鲟鱼I型胶原蛋白的体外培养过程中，外界盐度的变化对于鲟鱼I型胶原蛋白性状会造成显著影响，主要表现为胶原纤维形成速度加快、胶原纤维形态加粗，可对组织硬度造成影响[19,20]。胶原蛋白纤维形成能力是胶原蛋白重要的生物学特性，胶原纤维的形成速度及纤维形态会对肌膜产生直接影响，进一步影响肌肉的质构特性。在本实验中，在肌膜中胶原纤维的观察中发现，种青养殖模式下的草鱼肌膜中的胶原纤维成密集的束状，排列整齐紧密，而饲料养殖模式下的肌膜中的胶原蛋白纤维较疏松，这也与种青养殖模式下草鱼肌肉中I型胶原蛋白相关基因的表达与含量的提升趋势一致。

胶原蛋白富含多种人体需要的氨基酸，同时还含有在一般蛋白中少见的羟脯氨酸，营养价值丰富[19]。胶原蛋白具有较高的生物相容性和生物降解性，同时其生物抗原性较低，被广泛应用于食品、化妆品和医药用品等行业[19-21]。近年来，鱼类胶原蛋白作为一种胶原蛋白资源来源，与陆生动物胶原蛋白相比，具有避免疯牛病等人兽共患症和宗教信仰的优势，应用前景更加广泛[20-23]。因此，种青养殖草鱼胶原蛋白含量的提升，也进一步提升了草鱼的营养价值和产业应用价值。

本研究从肌肉组织学、胶原蛋白含量及胶原蛋白相关基因表达方面解析了种青养殖模式对草鱼肌肉胶原蛋白的相关影响。研究表明种青养鱼模式可提升草鱼肌肉中胶原蛋白的含量，并从分子生物学角度初步解析了其作用机制，为提升草鱼肌肉品质和健康养殖模式提供了理论基础和数据支持。