陈两绵 邹芳艳 刘晓谦 高慧敏 张永欣 冯伟红 郭中原 王智民

摘要 目的：分析和比較忍冬药用部位（金银花和忍冬藤）和非药用部位（忍冬叶）的体外抗氧化活性，为忍冬非药用部位——忍冬叶的综合利用和产品开发提供科学依据。方法：分别采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）法和铁离子还原能力（FRAP）微量法测定45份金银花、忍冬叶和忍冬藤样品的抗氧化活性，并分别采用描述性统计、直观分析、系统聚类分析（HCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）等统计学方法进行数据处理和挖掘。结果：3种方法测定的抗氧化活性结果基本相似，测定结果具有较高的可信度。不同产地的金银花、忍冬叶和忍冬藤抗氧化活性大小：连云港≥河南>山东（金银花）;连云港>河南>山东（忍冬叶）;河南≥山东≥连云港（忍冬藤）。忍冬藤的抗氧化活性较弱，金银花和忍冬叶的抗氧化活性较强。金银花和忍冬叶的抗氧化活性大小因其产地不同而存在差异：忍冬叶≈金银花（河南），忍冬叶>金银花（连云港），忍冬叶<金银花（山东）。HCA和PLS-DA分析将45份样品分为2个组别，其中忍冬藤为一组，金银花和忍冬叶为另一组。忍冬藤的抗氧化活性明显不同于金银花和忍冬叶，而金银花和忍冬叶的抗氧化活性则较为相近。结论：忍冬植物的非药用部位——忍冬叶资源丰富，其抗氧化活性比忍冬藤强，与金银花相当，极具综合利用价值和产品开发潜能。

关键词 忍冬;非药用部位;忍冬叶;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼;2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐;铁离子还原能力;抗氧化活性;微量法

Comparison of Antioxidant Activities between the Medicinal Parts and Non-Medicinal Parts of Lonicera japonica by Three Test Methods

CHEN Liangmian1，ZOU Fangyan1，2，LIU Xiaoqian1，GAO Huimin1，ZHANG Yongxin1，FENG Weihong1，GUO Zhongyuan1，WANG Zhimin1

（1 National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Materia Medica， Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2 Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China）

Abstract Objective：To analyze and compare the antioxidant activities in vitro between the medicinal parts[Lonicerae Japonicae Flos（LJFs） and Lonicerae Japonicae Caulis（LJC）]and the non-medicinal parts[Lonicerae Japonicae Folium（LJFm）]of Lonicera japonica Thunb and provide a scientific basis for the comprehensive utilization and product development of LJFm-the non-medicinal parts of Lonicera japonica Thunb.Methods：A total of 3 micro-models of 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH），2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt（ABTS） and ferric reducing antioxidant power（FRAP） were used respectively to determine the antioxidant activities of 45 samples of LJFs，LJFm and LJC.And descriptive statistics，visual analysis，hierarchical cluster analysis（HCA） and partial least squares discrimination analysis（PLS-DA） were used separately for data processing and mining.Results：The antioxidant activities of 45 samples determined by 3 micro-models were basically consistent，which showed that the measurement results had high reliability.The antioxidant activities of the samples from different producing areas：Lianyungang≥Henan>Shandong（LJFs）; Lianyungang>Henan>Shandong（LJFm）; Henan≥Shandong≥Lianyungang（LJC）.Furthermore，the antioxidant activity of LJC was weak，while that of LJFs and LJFm was strong.The antioxidant activities between LJFs and LJFm varied with the different producing areas，for instance，LJFm≈LJFs（Henan），LJFm>LJFs（Lianyungang），and LJFm

Keywords Lonicera japonica; Non-medicinal parts; Lonicerae Japonicae Folium; DPPH; ABTS; FRAP; Antioxidant activity; Micro-model

中图分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.001

忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）是我国传统的药用植物，其花、叶和茎分别称为金银花、忍冬叶和忍冬藤。忍冬在不同的历史时期以不用的部位入药。宋代及宋代以前只用忍冬叶和忍冬藤，自明代起明确以金银花入药，并逐步发展为花、叶和茎并用，自清代起则贵花而贱藤[1]。《本草纲目》曰：“忍冬，茎叶同花，功用皆同。”[2]金银花、忍冬叶和忍冬藤均具有清热解毒、疏散风热之功效，可用于痈肿疔疮，热毒血痢，温病发热等的治疗[3-4]。现代研究表明，金银花、忍冬叶和忍冬藤均含有酚酸、黄酮、环烯醚萜、三萜皂苷、多糖和挥发油等多种成分[5-8]，均具有抗菌、抗病毒、解热抗炎、抗氧化、保肝利胆、降糖降脂和抗肿瘤等药理作用[9-12]。尽管如此，目前《中华人民共和国药典》[3]仅收载了金银花和忍冬藤，而忍冬叶被视为忍冬的非药用部位，尚未得到充分利用。忍冬叶资源丰富，在忍冬的种植过程中，其产量是金银花的10倍左右，大多作为非药用部位被废弃，造成了极大的资源浪费。

现代质量评价常采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定指标性成分的含量，但仅用几个指标性成分难以全面表征其内在质量，而生物测定法中的抗氧化活性测定法是对有效成分群的整体评价，比较能表征清热解毒类中药的活性。忍冬的主要化学成分为酚酸和黄酮类成分，因其酚羟基结构使之具有良好的抗氧化活性。常用的体外抗氧化活性测定方法有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法、2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid） Diammonium Salt，ABTS]法和铁离子还原能力（Ferric Reducing Antioxidant Power，FRAP）法[13-15]，3种方法都是基于紫外-可见分光光度法进行抗氧化活性测定。然而，传统的紫外-可见分光光度法，样品消耗大、多样品测定时操作烦琐、耗时长，且常因反应条件不同导致抗氧化活性测定结果出现不一致的情况。有研究采用基于酶标仪-酶标板的DPPH、ABTS和FRAP微量法测定样品的抗氧化活性，由于操作的便捷快速、高通量和半自动化，不仅可以降低能耗、节省时间、提高工作效率，而且可以获得稳定、可靠的测定结果[16-18]。因此，本研究基于DPPH、ABTS和FRAP微量法，分析和比较忍冬药用部位和非药用部位的体外抗氧化活性，为忍冬的非药用部位——忍冬叶的综合利用和产品开发提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 酶标仪（Thermo-Fisher公司，美国，型号：Multiskan go）;万分之一电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司，型号：BSA-124S-CW）;十万分之一电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，型号：XSE 105DU];漩涡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QL-901）;超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-250DB）;离心机（上海安亭科兴仪器厂，型号：TGL-16G）;酶标板（康宁生命科技有限公司，美国，型号：96孔）;移液枪（Eppendorf公司，德国，型号：2～20 μL，10～100 μL和20～200 μL）。

1.2 试剂 DPPH（纯度≥98%，Sigma公司，德国，批号：1001173304）;2，4，6-三吡啶基-1，3，5-三嗪（纯度≥98%，TPTZ，Sigma公司，德国，批号：101091144）;ABTS[纯度>98%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，批号：1014011203];其余试剂均为分析纯。

1.3 分析样品 分别于2014年5月和2015年5月前往山东、江苏连云港和河南等地，采集忍冬不同部位的样品，合计采集金银花、忍冬叶和忍冬藤样品45份，样品的具体情况见表1。上述样品经国医大师金世元教授鉴定其来源为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 分别取金银花、忍冬叶和忍冬藤粉末（过40目筛）约0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇溶液20 mL，称定重量，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理20 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为样品储备溶液;取样品储备溶液适量，用70%甲醇稀释成不同质量浓度系列的溶液，即为供试品溶液。

2.2 DPPH微量法的建立

2.2.1 DPPH乙醇溶液的制备 精密称取DPPH 4.93 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加95%乙醇溶解并稀释至刻度，避光放置，即得0.125 mmol/L的DPPH乙醇溶液。

2.2.2 DPPH自由基清除率测定 分别精密移取系列质量浓度的供试品溶液50 μL及DPPH乙醇溶液200 μL于96孔酶标板中，混合均匀，在适宜反应时间内使反应达到动态平衡后，于515 nm下测定吸光度，记为Ai。同时，以50 μL 70%甲醇与200 μL DPPH乙醇溶液作为对照组，其吸光度记为A0;以50 μL 70%甲醇与200 μL 95%乙醇作为空白组，其吸光度记为Aj，按DPPH自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%，计算清除率，以质量浓度（g/L）为横坐标，清除率（%）为纵坐标，绘制清除率曲线，进一步计算获得半数清除率（EC50）。

2.2.3 供试品溶液最适质量浓度系列的确定 分别按照2.1项方法制备金银花、忍冬叶和忍冬藤的供试品储备液，并稀释成系列质量浓度的供试品溶液，按照2.2.2项下方法测定清除率，并绘制清除率曲线。金银花样品溶液的质量浓度系列为0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.30、1.60、2.00 g/L等10种;忍冬叶样品溶液的质量浓度系列为0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.10、1.30、1.60、2.00、2.50 g/L等10种;忍冬藤样品溶液的质量浓度系列为0.50、0.90、1.30、1.70、2.10、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50 g/L等10种。在当前质量浓度系列下，DPPH自由基清除率较为均匀地分布在10%～90%范围内，故确定以上质量浓度系列作为供试品溶液的最适质量浓度系列。见图1。

2.2.4 反应时间的确定 分别移取低、中和高3种质量浓度的供试品溶液（金银花：0.10、0.80、1.60 g/L;忍冬叶：0.30、0.90、2.00 g/L;忍冬藤：0.90、2.10、4.00 g/L），按照2.2.2项下方法，于反应时间分别为5、10、15、20、25、30、40、45、50、55、60 min时测定吸光度Ai，观察各浓度下Ai的变化情况。结果显示，当反应时间为40 min时，其Ai与相邻时间点（35 min和45 min）Ai的相对偏差（Relative Deviation，RD）均小于5%，表明40 min能使反应达到动态平衡，故确定反应时间为40 min。

2.3 ABTS微量法的建立

2.3.1 ABTS自由基工作液的制备 分别移取7.0 mmol/L的ABTS溶液5 mL和140 mmol/L的K2S2O8溶液88 μL，混合均匀后，避光放置12～16 h，得ABTS自由基储备液[19]。使用前，移取ABTS自由基储备液2.0 mL，置于100 mL棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得ABTS自由基工作液。

2.3.2 ABTS自由基清除率测定 分别精密移取系列质量浓度的供试品溶液50 μL及ABTS自由基工作液200 μL于96孔酶标板中，混合均匀，在适宜反应时间内使反应达到动态平衡后，于734 nm下测定吸光度Ai。同时，以50 μL 70%甲醇与200 μL ABTS自由基工作液作为对照组，吸光度为A0;以50 μL 70%甲醇与200 μL蒸馏水作为空白组，吸光度为Aj，按ABTS自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%，计算清除率，以质量浓度（g/L）为横坐标，清除率（%）为纵坐标，绘制清除率曲线，进而获得EC50。

2.3.3 供试品溶液最适质量浓度系列的确定 分别按照2.1项方法制备金银花、忍冬叶和忍冬藤的供试品储备液，并稀释成系列质量浓度的供试品溶液，按照2.3.2项下方法测定清除率，并绘制清除率曲线。当金银花、忍冬叶和忍冬藤样品溶液的质量浓度系列与2.2.3项下的质量浓度系列相同时，ABTS自由基清除率较为均匀地分布在10%～99%范围内，故确定ABTS法的供试品溶液最适质量浓度系列与DPPH法保持一致。见图2。

2.3.4 反应时间的确定 分别移取低、中和高3种质量浓度的供试品溶液（金银花：0.10、0.80、1.60 g/L;忍冬叶：0.20、0.70、1.60 g/L;忍冬藤：0.90、2.10、4.00 g/L），按照2.3.2项下方法，于反应时间分别为5、10、15、20、25、30、35、40 min时测定吸光度Ai，观察各浓度下Ai的变化情况。结果显示，当反应时间为25 min时，其Ai与相邻时间点（20 min和30 min）Ai的RD均小于5%，表明25 min能使反应达到动态平衡，故确定反应时间为25 min。

2.4 FRAP微量法的建立

2.4.1 FRAP工作液的制备 分别移取0.30 mol/L醋酸盐缓冲溶液25 mL，10 mmol/L TPTZ溶液2.5 mL和20 mmol/L三氯化铁溶液2.5 mL，混合均匀，即得FRAP工作液[20]，临用前现配。

2.4.2 FeSO4当量测定 分别精密移取适宜质量浓度的供试品溶液10 μL及FRAP工作液200 μL于96孔酶标板中，混合均匀，37 ℃温育适宜时间，使反应达到动态平衡后，于593 nm下测定吸光度Ai，同时，以10 μL 70%甲醇与200 μL FRAP工作液作为空白组，吸光度为Aj。FeSO4当量使用FeSO4标准曲线进行换算，表示为mmol/g。

2.4.3 标准曲线的绘制 配制摩尔浓度分别为0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.20、1.60、2.00 mmol/L FeSO4溶液，按照2.4.2项下方法测定Ai和Aj，以吸光度（Ai-Aj）为纵坐标（y），FeSO4浓度（mmol/L）为横坐标（x），绘制标准曲线，得回归方程：y=0.615 4x+0.009 0（r=0.999 0），FeSO4溶液在0.20～1.60 mmol/L（n=6）与吸光度呈现良好的线性关系。

2.4.4 供试品溶液最适质量浓度的确定 分别按照2.1项方法制备金银花、忍冬叶和忍冬藤的供试品储备液，并稀释成系列质量浓度的供试品溶液，按照2.4.2项下方法测定吸光度（Ai-Aj），参照2.4.3项下FeSO4溶液线性范围所对应的吸光度（Ai-Aj）范围，确定金银花供试品溶液的最适质量浓度为1.25 g/L，忍冬葉供试品溶液的最适质量浓度为1.25 g/L，忍冬藤供试品溶液的最适质量浓度为3.75 g/L。

2.4.5 反应时间的确定 分别移金银花、忍冬叶和忍冬藤的供试品溶液，按照2.4.2项下方法，于反应时间分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min时测定吸光度Ai，观察各浓度下Ai的变化情况。结果显示，当反应时间为50 min时，其Ai与相邻时间点（45 min和55 min）Ai的RD均小于5.0%，表明反应时间50 min能使反应达到动态平衡，故确定反应时间为50 min。

2.5 样品测定 分别采用2.2、2.3和2.4项下的DPPH、ABTS和FRAP微量法，测定45份样品（金银花、忍冬叶和忍冬藤）的抗氧化活性。DPPH和ABTS微量法中，样品的抗氧化活性采用EC50（g/L）表征，EC50值越小，表示样品的抗氧化活性越强;FRAP微量法中，样品的抗氧化活性采用FeSO4当量（mmol/g）表征，FeSO4当量越大，表示样品的抗氧化活性越强。见表2。

2.6 抗氧化活性比较

2.6.1 描述性统计 采用SPSS 19.0统计软件，分别对表2中金银花、忍冬叶和忍冬藤样品的3项抗氧化活性指标进行描述性统计分析。金银花样品的3项指标的变异系数为13.7%～20.1%（n=15），忍冬叶样品的3项指标的变异系数为32.6%～36.2%（n=15），忍冬藤样品的3项指标的变异系数为13.9%～23.2%（n=15），其变异系数均>10%，表明金银花、忍冬叶和忍冬藤样品的抗氧化活性均存在较大差别，其中忍冬叶各样品间的差别更为明显。见表3。

2.6.2 直观分析 根据表2的抗氧化活性测定结果，对相同产地的金银花、忍冬叶和忍冬藤样品分别计算均值和标准差（±s，n=5），并分别比较金银花、忍冬叶和忍冬藤在不同产地条件下的抗氧化活性大小。见图3。DPPH、ABTS和FRAP微量法的测定结果基本相似，表明其测定结果具有较高的可信度。不同产地金银花的抗氧化活性：连云港≥河南>山东;不同产地忍冬叶的抗氧化活性：连云港>河南>山东;不同产地忍冬藤的抗氧化活性：河南≥山东≥连云港。同时，在相同产地条件下，分别比较金银花、忍冬叶和忍冬藤的抗氧化活性。见图4。DPPH、ABTS和FRAP微量法的测定结果亦基本相似，其抗氧化活性大小分别为：忍冬叶≈金银花>忍冬藤（河南），忍冬叶>金银花>忍冬藤（连云港），金银花>忍冬叶>忍冬藤（山东）。总的说来，忍冬藤的抗氧化活性较弱，金银花和忍冬叶的抗氧化活性较强，金银花和忍冬叶的抗氧化活性大小因其产地不同而存在差别，但总体差别较小。

2.6.3 系统聚类分析 采用SPSS 19.0统计软件，以DPPH法EC50、ABTS法EC50和FeSO4当量为变量，以45份金银花、忍冬叶和忍冬藤样品Z-score标准化处理后的数据为个案，采用组间联接法、平方Euclidean距离度量标准进行聚类分析，获得样品的分类情况。系统聚类分析将45份样品分为2个大组，其中忍冬藤为一组，金银花和忍冬叶为一组，表明忍冬藤的抗氧化活性明显不同于金银花和忍冬叶。其次，在金银花和忍冬叶这一组别下细分的小组中，既有金银花样品也有忍冬叶样品，表明金银花和忍冬叶的抗氧化活性较为相近，这与直观分析的结果保持一致。见图5。

2.6.4 偏最小二乘-判别分析 采用SIMCA-P 12.0软件，以DPPH法EC50、ABTS法EC50和FeSO4当量为变量，以45份金银花、忍冬叶和忍冬藤样品Z-score标准化处理后的数据为观测值，根据样品类型设置组别：金银花样品设置为组别1，忍冬叶样品设置为组别2，忍冬藤样品设置为组别3，进行偏最小二乘-判别分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA），前2个主成分的样品得分散点图见图6。提取的前2个主成分对总方差的累积贡献率为97.0%，表明前2个主成分可以很好地表征样品的原始信息。45份样品被分成2个组别，其中忍冬藤样品为一组，处于t[1]的负值区域;金银花和忍冬叶样品为一组，处于t[1]的正值区域且在t[2]的正负值区域离散分布。PLS-DA分析验证了系统聚类分析的结果，结合直观分析结果可知，忍冬叶的抗氧化活性比忍冬藤强，与金银花相当。

3 讨论

DPPH法、ABTS法和FRAP法是最为常用的体外抗氧化活性测定方法，其中DPPH法和ABTS法是表征抗氧化物质对自由基的清除能力。DPPH·是一种稳定的有机氮自由基，在乙醇溶液中呈深紫色，当抗氧化物质的氢与其单电子结合后，会使溶液颜色减退，吸光度减小;ABTS经K2S2O8氧化后可生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS·+，抗氧化物质可与ABTS·+发生反应使其溶液褪色，吸光度减小。2种方法均是根据吸光度的减小程度来评价物质的抗氧化活性，常以EC50作为评价指标。FRAP法是表征抗氧化物质对金属离子的还原能力。溶液中前期形成的无色的Fe3+（TPTZ）2Cl3络合物，在酸性条件下可以被抗氧化物质还原，生成有颜色的Fe2+络合物。因此，FRAP法是根据吸光度的增加程度来评价物质的抗氧化活性，常以FeSO4当量作为评价指标。但是，由于各方法的反应原理和条件不同，通常测定的结果并不完全一致，需要同时配合使用才可以提高评价的准确性和可靠性。此外，与传统的紫外-可见分光光度法比较，基于酶标仪-酶标板的微量法可操作性强，结果可靠，能够高通量、半自动化、快速地测定抗氧化物质的抗氧化活性。因此，我们分别采用DPPH、ABTS和FRAP微量法测定忍冬药用和非药用部位的抗氧化活性，其结果显示，3种方法测定的抗氧化活性结果基本保持一致，表明其测定结果具有较高的可信度。

忍冬中的主要化学成分为酚酸类和黄酮类等酚类物质，酚类物质是具有一个或多个芳香环连接一个或多个羟基的一类化合物，因其多个酚羟基的存在使之具有良好的抗氧化活性[19]。尽管有文献报道忍冬中三萜类和多糖类成分亦具有一定的抗氧化活性[21-22]，但与其中的酚类成分比较，抗氧化活性相对较弱;而环烯醚萜类成分几乎没有抗氧化活性[23]。金银花与忍冬叶主成分含量相似，与忍冬藤差异较大[8]，前二者含有较多的酚类物质，后者酚类含量相对较低，以马钱苷为代表的环烯醚萜类含量更高。因此认为金银花、忍冬叶和忍冬藤的抗氧化活性强弱与其内在酚类成分群的含量高低密切相关。

金银花、忍冬叶和忍冬藤在不同产地条件下的抗氧化活性存在差别，金银花：连云港≥河南>山东，忍冬叶：连云港>河南>山东，忍冬藤：河南≥山东≥连云港，这可能与产地的生长环境（土壤、气候、水分等）、采收年份、采收时期和干燥过程等因素密切相关。對于金银花、忍冬叶和忍冬藤三者之间的抗氧化活性大小，忍冬藤的抗氧化活性明显弱于金银花和忍冬叶，而忍冬叶和金银花之间的抗氧化活性大小则因其产地的不同而存在差别，比如，河南：忍冬叶≈金银花，连云港：忍冬叶>金银花，山东：忍冬叶<金银花。这从侧面说明，忍冬叶和金银花的抗氧化活性较为相近。HCA和PLS-DA分析将金银花和忍冬叶归为同一组，验证了直观分析的结果。总的说来，忍冬叶作为忍冬植物的非药用部位，其抗氧化活性比忍冬藤强，与金银花相当，具有极强的应用价值。忍冬叶资源丰富，生药量庞大，价格低廉，可以在提取物制备、地方特色食品或新资源食品申报、饮品开发和忍冬叶茶制作等多个方面加以综合利用和开发。

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（2021-08-06收稿 责任编辑：王明）