秦 宁 李俊茹 李文龙 杜 汇 李喜焕 张彩英

（河北农业大学/华北作物改良与调控国家重点实验室，071001，河北保定）

大豆是重要的粮食与油料作物，含约40%的蛋白质和20%的脂肪，是人们膳食结构中不可替代的植物蛋白和食用油来源[1-4]。同时，大豆中还含有多种生物活性物质，如维生素E、异黄酮和皂苷等[5-6]。有报道称，生育酚（维生素E）是一种脂溶性物质，具有抑制不饱和脂肪酸氧化、防止人体动脉硬化、降低胆固醇、增强血液循环和防治心血管疾病等多种功效，对维持人体多种正常生理活动具有重要作用，并且生育酚还可用作食品添加剂和药品营养剂，在食品加工和医药行业具有重要用途[7-8]。然而，由于人体自身并不能合成生育酚，需从外界摄取，使得生育酚以10%的年需求量递增[9-11]。有学者提出，大豆含有较其他植物更为丰富的生育酚，但目前尚未被深入挖掘利用[12-13]。因此，分析和评价不同来源大豆的品种资源籽粒生育酚及其组分含量，对满足当前及今后生育酚的市场需求以及提升大豆产品经济价值有重要意义。

目前，已有少数学者针对大豆品种资源籽粒生育酚及其组分含量开展相关研究。赵霞等[14]采用高效液相色谱法（HPLC）测定8个大豆品种生育酚组分含量，结果发现，HPLC方法稳定、准确、可靠，并筛选出高α-生育酚含量的大豆品种SZ910；李海燕等[12]采用HPLC方法分析黑龙江大豆品种合丰25与Bayfield杂交构建的300个RIL家系生育酚含量，结果发现，各供试家系以哈尔滨地区大豆的籽粒生育酚含量最高；王丽等[15]以吉林省农业科学院提供的180份栽培大豆和野生大豆为材料，研究结果发现，在脂肪含量相同的条件下，栽培大豆生育酚含量高于野生大豆；李桂华等[16]分析来自东北地区和黄淮流域的100多份大豆资源生育酚含量，结果认为，东北地区大豆资源生育酚含量高于黄淮流域；刘焕成等[17]测定我国东北地区大豆品种资源与北美大豆籽粒生育酚及其组分含量，结果发现，东北大豆资源生育酚含量明显高于北美大豆；代红丽等[18]分析我国东北和黄淮地区大豆资源与美国转基因大豆生育酚含量，结果发现，东北大豆α-生育酚和β-生育酚含量显著高于黄淮地区大豆和美国转基因大豆，同时提出东北大豆是高质量生育酚的重要来源。

由以上研究结果可见，东北地区大豆品种资源类型丰富，且籽粒生育酚含量相对较高，尽管目前已有学者针对该地区少数大豆资源籽粒生育酚含量开展研究，但相较于大豆其他品质性状的研究而言，报道甚少，且筛选出的优异种质远不能满足育种与生产需求。因此，亟需进一步针对该地区大豆品种资源开展更广泛的研究，以深入挖掘其潜在的高生育酚含量的优异种质。鉴于此，本研究以东北生态区的299份大豆品种资源为材料，分析籽粒生育酚及其组分含量，明确供试品种资源籽粒生育酚及其组分含量遗传差异，研究其相关关系，并筛选高生育酚含量的优异种质，为今后通过常规育种及分子育种方法实现大豆生育酚及其组分含量遗传改良奠定材料基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为299份大豆品种资源，主要来自东北生态区，由中国农业科学院作物科学研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 种植方法 供试大豆品种于2019年6月在河北农业大学作物育种中心种植，行长1.5m，行距0.5m，完全随机区组设计，2次重复。

1.2.2 生育酚提取方法 选取均匀一致、健康无损伤的大豆籽粒20～30粒，用磨样机粉碎，过60目筛，称取0.05g，加入1.5mL 80%色谱乙醇溶液（乙醇∶水=4∶1），振荡15s混匀，置于超声波中15min；静置15min，振荡20s混匀，再置于超声波中萃取15min，然后在13000转/min下离心15min；吸取上清液，经0.25μm滤膜过滤后，在设定的色谱条件下采用高效液相色谱法测定生育酚含量[19]。

1.2.3 生育酚组分标准曲线绘制方法 试验所用δ-、γ-、α-生育酚标准品均购自Sigma公司，纯度≥96%；称取一定量上述标准品，并分别配制成浓度为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0μg/mL 的δ-、γ-生育酚标准溶液以及 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μg/mL的α-生育酚标准溶液；随后在设定的色谱条件下分别进样，获得峰面积；利用样品浓度X（μg/mL）与峰面积Y进行回归分析，获得拟合后的标准曲线方程。

1.2.4 生育酚组分高效液相色谱条件设定 采用安捷伦1260型高效液相色谱仪测定大豆籽粒生育酚组分含量，色谱条件为：荧光检测器检测波长330nm，流动相为色谱乙腈∶色谱甲醇（9∶1），流速1mL/min，柱温40℃，进样量20μL，检测时间14min。

1.3 数据统计与分析

利用SPSS 21.0进行描述统计、方差分析、相关性分析与聚类分析，其中聚类分析采用系统聚类欧式距离类平均法[20-21]。

2 结果与分析

2.1 大豆籽粒生育酚组分含量标准曲线方程的确定

通过配制不同浓度大豆籽粒生育酚组分含量标准溶液，经高效液相色谱方法获得峰面积，通过回归分析，获得3个组分含量标准方程，δ-生育酚、γ-生育酚和α-生育酚标准方程分别为Y=8.6954X+2.9000（R2=0.9991）、Y=10.0330X+4.7000（R2=0.9992）和Y=3.4143X+0.7438（R2=0.9990），由3个回归方程决定系数R2可知，试验所用方法获得的回归方程拟合效果好，可用于大豆籽粒生育酚及其组分含量测定。

2.2 大豆籽粒生育酚及其组分含量遗传变异分析

通过分析供试大豆品种资源籽粒生育酚及其组分含量（表 1）发现，δ-、γ-、α-生育酚及总生育酚含量在不同大豆品种间的差异达到极显著，说明供试品种资源籽粒生育酚含量存在差异；进一步分析各组分及其总量发现，δ-、γ-、α-生育酚及总生育酚平均含量分别为44.15、143.05、66.81及254.01μg/g，其变异系数在15.37%～38.04%之间，α-生育酚含量变异系数最高，说明供试大豆品种资源籽粒生育酚及其组分含量存在丰富遗传变异，能够从中筛选出高含量特异种质。δ-、γ-、α-生育酚与总生育酚比值分别为17.47%、56.57%和25.96%，其变异系数为11.78%～32.21%，α-生育酚含量比值变异系数最高。另外，通过分析供试品种资源各组分含量次数分布（图1）及其偏度和峰度系数（表1）发现，偏度和峰度系数值均接近0，符合正态分布，属于多基因控制数量性状。

图1 供试大豆籽粒生育酚及其组分含量分布情况Fig.1 The distribution of tocopherol and its component contents in soybean varieties

表1 供试大豆籽粒生育酚及其组分含量遗传变异Table 1 Genetic variation of tocopherol and its component contents in soybean varieties

2.3 大豆籽粒生育酚及其组分含量间的相关性分析

通过分析供试大豆品种资源籽粒生育酚及其组分含量间的相关性，结果（表2）发现，总生育酚与3种组分含量间的相关性均达到极显著，并以总生育酚含量和γ-生育酚间的相关系数最高（r=0.753），其次为总生育酚含量和α-生育酚相关系数（r=0.608）；δ-生育酚与γ-生育酚含量间的相关系数也达到极显著（r=0.452），而α-生育酚与γ-生育酚之间的相关性未达显著水平。各成分比值间以及比值与总含量间的相关系数均达到显著或极显著水平。结果可为实现大豆籽粒生育酚及其组分含量同步遗传改良提供一定参考。

表2 供试大豆籽粒生育酚及其组分含量相关性分析Table 2 Correlation analysis of tocopherol and its component contents in soybean varieties

2.4 供试大豆品种资源生育酚及其组分含量聚类分析

对供试大豆品种资源籽粒生育酚及其组分含量进行系统聚类分析，结果（表3）发现，在欧氏距离15时，可将供试材料分为3类，即生育酚高含量、低含量和中间含量类型，其中Ⅰ类为高含量大豆资源，包括黑河44、合丰50、合农75、绥农28和合丰55等，其生育酚总含量平均为319.37μg/g；Ⅱ类为低含量大豆资源，包括合农69、青豆、紫花2、宝青绿大豆和东农47等，其生育酚总含量平均为178.30μg/g；Ⅲ类为中间含量类型，包括吉育204、绥农26、长春满仓金和绥08-5331等，其生育酚总含量平均为249.98μg/g。

表3 供试大豆品种资源籽粒生育酚及其组分含量聚类分析Table 3 Cluster analysis of tocopherol and its component contents in soybean varieties μg/g

2.5 大豆籽粒高生育酚及其组分含量特异种质筛选

基于各供试大豆品种资源籽粒生育酚及其组分含量，筛选出高生育酚及其组分含量特异种质13份（表4），其中总生育酚含量较高的品种有5个，即黑河 44（382.86μg/g）、合丰 50（351.36μg/g）、合农 75（350.05μg/g）、绥农 28（347.34μg/g）和合丰55（343.02μg/g）；δ-生育酚含量较高的品种有3个，即哈 12-4547（86.92μg/g）、东辽克霜（83.46μg/g）和辽10Q015（75.64μg/g）；γ-生育酚含量较高的品种有2个，即蒙豆9号（207.09μg/g）和蒙豆36（198.52μg/g）；α-生育酚含量较高的品种有3个，即绥农 1 号（163.49μg/g）、哈 13-2089（153.10μg/g）和东农42（140.83μg/g）。这些优异种质的筛选一方面为大豆籽粒生育酚常规育种提供了亲本资源，另一方面也为通过分子育种手段实现该性状遗传改良奠定了重要材料基础。

表4 筛选的大豆籽粒高生育酚及其组分含量特异种质Table 4 The soybean germplasms with high tocopherol and its component contents in seed μg/g

3 讨论

生育酚是一种透明淡黄色黏稠油状物，在光照、碱及金属离子条件下易降解[22]。有报道称，生育酚有多种营养和医药价值，是人类食品重要营养成份之一，每天吸收7～9mg的α-生育酚，能够保证人体中枢神经和血管系统正常功能，每天吸收100～1000mg的α-生育酚，则可起到延缓人体衰老、防紫外线等功效[23]。同时有学者指出，相比于其他农作物而言，油料作物籽粒中的生育酚含量相对较高，尤其以油菜和大豆含量较为丰富，因而成为食品和医药行业维生素E的重要来源[24-26]。由此可见，鉴定评价不同大豆品种资源籽粒生育酚及其组分含量，发掘利用大豆生育酚优异种质具有重要意义。

关于大豆品种资源籽粒生育酚含量的鉴定，目前有少数学者已开展研究，并获得少数高含量特异种质。罗健等[19]以东北三省及内蒙古大豆产区的180份种质资源为材料，采用高效液相色谱法检测其籽粒生育酚及其组分含量，结果发现，供试材料中合丰50与L-21的生育酚含量最高（分别为313.03和295.55μg/g）；同时，其他学者也已证实东北大豆蕴藏着丰富的生育酚资源[16-18]。鉴于此，本研究以东北地区的大豆品种资源为材料，经测定其籽粒生育酚及其组分含量，结果发现，供试品种生育酚及其组分含量存在较大遗传变异，并从中筛选出高含量特异种质13份，其中合丰50生育酚总含量达到351.36μg/g，与罗健等[19]测定该品种结果比较一致，另有12份高生育酚含量优异种质未见报道。上述优异种质的筛选为继续采用常规育种与分子育种手段改良大豆生育酚含量提供重要资源。

4 结论

通过测定299份大豆品种资源籽粒生育酚及其组分含量发现，供试品种生育酚及其组分含量存在丰富遗传变异，δ-、γ-、α-生育酚及总生育酚平均含量分别为44.15、143.05、66.81及254.01μg/g，变异系数为15.37%～38.04%，以α-生育酚变异系数最高；3种成分占总含量比值分别为17.47%、56.57%和25.96%，变异系数为11.78%～32.21%，以α-生育酚比值变异系数最高；总生育酚含量与3种组分间显著相关，δ-生育酚与γ-及α-生育酚亦显著相关。根据各品种生育酚及其组分含量，筛选出13份高生育酚含量特异种质，为实现大豆生育酚及其组分含量遗传改良奠定了材料基础。