雍苏南，龙远雄，蔺晓源

高血压是临床常见的慢性病和多发病，血压水平与心血管风险呈连续、独立、直接的正相关，将导致脑卒中、冠心病、终末期肾病等，严重威胁人类生命健康[1]。我国第6次(2012年—2015年)高血压抽样调查数据显示，18岁及以上居民高血压患病率粗率为27.9%，标化率为23.2%[2]。全球现有高血压病人超过10亿人，预计到2025年，高血压人群可能突破15亿人[3]。西药治疗高血压虽然降压效果确切，但是多以单纯控制血压为主，长期使用存在依赖性大、副作用多且经济负担重等诸多弊端，而中医药在高血压的防治方面，具有多靶点、多途径、毒副作用小等独特优势。

本课题组前期研究证实，运用具有养阴柔肝、化瘀通络功效的复方七芍降压片治疗高血压临床疗效确切[4-6]，其中三七、白芍为该方的君药，对于复方七芍降压片发挥临床疗效起到至关重要的作用。本研究运用网络药理学方法，通过生物信息学分析构建“化合物-靶点-疾病”网络，以期揭示三七、白芍治疗高血压的药效物质基础和作用机制，为高血压的中医药临床治疗提供药理研究基础。

1 资料与方法

1.1 三七、白芍有效化合物及作用靶点获取 本研究通过中药网络药理学平台检索三七、白芍的化学成分，并以口服吸收利用度(OB)≥30%、药物相似性(DL)≥0.18为筛选条件，提取各味中药的主要活性化合物。

1.2 高血压疾病靶点预测 利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)通过化合物MOL_ID编号检索其作用靶标，并通过Uniport数据库检索各靶点对应的基因名；基于GeneCards数据库，以“hypertension”为关键词检索相关基因，并与药物活性化合物靶点取交集，得到三七、白芍治疗高血压的相关作用靶点。

1.3 “有效化合物-作用靶点”网络的构建与分析 将三七、白芍活性化合物及其作用于高血压的相关靶点导入Cytoscape 3.7.1软件中，并利用“Network Analyzer”功能对中药化学成分-作用靶点网络进行分析，根据化合物与靶点连接情况筛选出三七-白芍治疗高血压的关键化合物。

1.4 蛋白质相互作用(PPI)网络构建及关键靶点筛选 将交集靶点导入STRING数据库中，并限定研究物种为人类，得到三七、白芍作用于高血压的PPI网络。借助Cytoscape 3.7.1软件中的“Network Analyzer”对PPI网络进行拓扑分析，选取自由度(degree)、介数(betweenness)和中心性(closeness)都大于平均值的靶点为关键靶点。

1.5 基因本体(GO)功能富集分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析 为进一步了解核心靶点基因功能和三七、白芍治疗高血压的主要作用通路，将药物与疾病相关靶点输入DAVID数据库，选定物种为“homo sapiens”，设定阈值P<0.05进行GO功能富集和KEGG通路分析，并对富集分析结果用R语言编程软件进行可视化处理。

2 结 果

2.1 三七、白芍有效化合物及作用靶点提取结果 通过TCMSP分析平台检索三七、白芍的主要有效成分，并设置口服生物利用度(OB≥30%)、类药性(DL≥0.18)，筛选出各药物有效成分，再根据有效成分“MOL_ID”获取各化合物的靶点(以蛋白名表示)。其中筛选三七有效化合物8个，白芍有效化合物13个，三七与白芍重复化合物1个：MOL000358(beta-sitosterol)，去重后有效化合物20个，逐一对应靶点时发现3个化合物找不到靶点，即三七-白芍药对有效化合物17个(三七7个，白芍11个，重复1个)，得到有效化合物靶点461个，去重后剩余靶点数为138个，再通过Uniprot获取各靶点基因名。详见表1。

表1 三七-白芍有效化合物基本信息表

(续表)

2.2 高血压疾病靶点预测 以“hypertension”为关键词，利用GeneCards数据库检索，得到与高血压相关的靶点7 811个，按“Relevance score”排序提取Relevance score≥5的靶点，共1 324个靶点作为高血压疾病相关的靶点，Relevance score 排名前50个的靶点详见表2。

表2 高血压疾病靶点(Relevance score排名前50个)

2.3 活性成分-疾病靶点网络构建与分析 三七-白芍去重后的有效化合物共20个(实际为17个化合物，其中有3个找不到靶点信息)，对应去重后的靶点数为138个，通过与GeneCards数据库中与高血压相关的靶点基因(1 324个)进行比对，其中有62个可能是与治疗高血压相关的作用靶点(交集靶点)。详见表3。

表3 三七-白芍治疗高血压相关的作用靶点

构建中药化学成分-作用靶点网络，利用Cytoscape 3.7.1软件中的“Network Analyzer”功能对中药化学成分-作用靶点网络进行分析，“节点”(node)代表三七-白芍所含药物化学成分与潜在作用靶点；“边”展现了中药成分和其作用靶点之间的联系，根据化合物与靶点连接情况筛选出三七-白芍作用于高血压的关键化合物。

将138个化合物靶点与1 324个高血压靶点基因取交集，得到62个交集基因，对应三七-白芍中16个候选化合物(白芍-MOL001924无交集靶点，故未进入分析)，其中对应三七化合物7个，白芍化合物10个，重复1个。借助软件Cytocsape 3.7.1构建中药化合物-靶点基因相互作用网络，网络中有78个节点(化合物节点16个，靶基因节点62个)和168条边，详见图1。图中度值最高的化合物为quercetin，其次为kaempferol、beta-sitosterol、Stigmasterol、DFV、(+)-catechin、Mandenol，详见表4，这些度值较高的化合物可能是三七-白芍发挥治疗高血压的关键化合物。

图1 有效化合物-作用靶点图

表4 三七-白芍治疗与高血压相关的关键化合物(自由度>5)

2.4 蛋白相互作用网络构建及关键靶点筛选 利用STRING数据库，对药物-疾病交集靶点(62个)进行PPI分析，研究物种设定为“Homo Sapiens”，获得三七-白芍用于高血压的PPI网络(见图2)，以TSV格式文件保存后，导入Cytoscape软件对PPI网络进行拓扑分析，选取自由度、介数和中心性都大于平均值的靶点为关键靶点。

图2 交集靶点PPI网络图

网络中有61个靶点发生蛋白相互作用(有1个靶点COLQ未与其他蛋白发生相互作用，已在PPI图中删除)，894条边代表了蛋白之间相互作用。网络中各节点的平均自由度为14.66，平均介数为57.81，平均中心度数为0.522，自由度、介数、中心度数均超过平均值的靶点有12个，详见表5。推测这些靶点可能是三七-白芍治疗高血压的关键靶点。

表5 三七-白芍治疗高血压关键基因基本信息表

2.5 GO功能与KEGG通路分析

2.5.1 GO功能分析结果 将药物-疾病交集基因导入DAVID6.8数据库，输入靶基因名称列表，限定物种为“Homo Sapiens”，阈值设定为P<0.05，进行GO功能分析和KEGG通路富集分析。62个基因影响了89个生物学过程，其中生物进程(BP)59个，细胞组分(CC)过程12个，分子功能(MF)过程18个，选取各类过程中P值排名前10的功能信息，其中P值越大，表示富集显著性最强(见表6)。用R软件进行可视化展示形成柱状图3，图中蓝色越深表示富集程度越显著，红色越深表示富集程度越不显著，柱状长度表示富集的基因数量，长度越长，表示富集基因数越多，发挥的作用可能越大。

图3 GO分析结果

表6 药物-疾病交集基因GO分析结果

2.5.2 KEGG分析结果 62个交集基因得到(P<0.05)通路共80条，选择富集显著排名前15的进行分析。详见图4。

图4 KEGG 分析结果

3 讨 论

本研究通过网络药理学研究方法，基于TCMSP、GeneCards、Uniprot、STRING等公共数据库以及Cytoscape等软件，系统科学地探讨了三七-白芍配伍治疗高血压病的作用机制。三七-白芍可能发挥抗高血压治疗作用的关键成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、食脂素、儿茶素、甘露醇。已有研究显示，槲皮素主要是通过调控ROS间接影响磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路，从而抑制炎症和凋亡的发生，最终减轻动脉粥样硬化程度，延缓高血压的发生[7]。张文通等[8]研究发现山柰酚-3-O-芸香糖苷能降低血管平滑肌细胞(VSMC)活力，减少迁移相关蛋白基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达，山柰酚-3-O-芸香糖苷可能通过抑制TGFBR1信号通路抑制VSMC的增殖和迁移，从而延缓斑块形成，预防高血压。β-谷甾醇和豆甾醇的药理作用广泛[9-10]，具有调节免疫、抗炎镇痛、调节血脂、抑制肿瘤等药理活性，而炎症反应能刺激血管内皮，导致内皮损伤，从而引起血压升高。β-谷甾醇可能通过抗炎作用来有效控制血压。儿茶素可有效预防心血管疾病，调节血脂水平、抗氧化损伤、抑制血栓形成和低密度脂蛋白的氧化，降低氧自由基，从而维持内皮稳态，维持血压正常[11]。

进一步进行GO功能和KEGG通路分析预测，结果显示，三七-白芍配伍治疗高血压作用机制的生物过程为氧化还原过程(富集靶点数10个)、细胞信号转导(富集靶点数6个)、腺苷酸酯活化肾上腺素能受体信号通路(富集靶点数5个)等；主要影响的细胞组分为质膜的组成成分(富集靶点数12个)、细胞外间隙(富集靶点数12个)、胞浆(富集靶点数12个)等；主要影响的分子功能为血红素结合(富集靶点数9个)、蛋白质均聚活性(富集靶点数7个)、丝氨酸型内肽酶活性(富集靶点数6个)。与高血压密切相关的通路为：肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、钙信号通路、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路、环磷酸鸟苷-蛋白激酶G(cGMP-PKG)信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号转导。而炎性因子参与高血压内皮损害过程，TNF-α可上调内皮细胞Fas表达，作用于Caspase-8、Caspase-3，从而引起微血管内皮细胞凋亡，导致内皮功能障碍[12]。研究表明，抑制VEGF-VEGF受体(VEGFR)通路可明显使血压升高，可见VEGF在血压的调节中发挥着重要作用，VEGF与VEGFR-2结合后，激活PI3K/AKT通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，上调内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，从而使一氧化氮(NO)表达增加[13]；另一方面，酪氨酸激酶c-Src被激活后，导致磷脂酶Cγ1活化、生成肌醇1，4，5-三磷酸酯、Ca2+释放、激活eNOS、介导其下游产物前列环素生成[14]，从而调控血管的生成、管壁的通透性及其舒缩功能，调节血压。因此，在生理状态下，内皮细胞通过内源性VEGF维持细胞稳态，通过VEGF信号通路促进血管生成、保证内皮功能的正常，这对稳定血压是至关重要的[15]。HIF-1与VEGF的相互作用是缺氧状态下毛细血管形成的主要机制[16]，HIF是由α和β两种不同亚基单位组成的异源二聚体蛋白，在机体正常状态下，HIF-1α会通过泛素化作用在细胞内降解，当组织缺氧时，HIF-1α则会在胞质聚集，转入胞核，HIF-α增强后激活VEGF的表达，同时HIF-1α可促进基质金属蛋白酶(MMP)的表达，导致内皮细胞的增殖、黏附，还可通过多种途径抑制线粒体氧化代谢，降低活性氧(ROS)水平，从而发挥抗细胞凋亡和保护血管内皮的作用[17]。另外，钙离子是参与人体各项生理活动的重要信使，储存于细胞外或内质网等细胞器中，若细胞内钙稳态失衡，可引起内质网应激、生长抑制和细胞凋亡，参与调控平滑肌收缩、增殖等过程，从而诱发心血管疾病[18]。王瑶函等[19]观察了cAMP对高血压鼠血管平滑肌细胞增殖的影响，发现cAMP可以通过抑制氧化应激的上下游信号通路抑制Giα蛋白的表达和细胞增殖，从而减轻高血压状态下氧化应激所诱导的并发症对机体和细胞的影响。同时，在sCG催化下，细胞内cGMP水平迅速升高，进一步激活下游靶点PKG，而PKG可增加通道活性，有效舒张血管平滑肌、扩血管、降血压[20]。

综上所述，三七-白芍的降压机制主要与抑制炎症反应、抗氧化应激、维持血管内皮稳态、调控血管平滑肌舒缩功能等多个方面有关。网络药理学作为一门新兴学科，基于系统生物学理论，强调对某个节点的多靶点分析，充分利用网络平衡的观点来认识药物对机体的作用，这种研究模式正符合中药复方治疗疾病的“整体观”以及其“多基因、多靶点、多通路”的疗效优势研究，具有重要的应用价值[21]。本研究挖掘了三七-白芍药对治疗高血压的诸多靶标，但因为公共数据库平台及软件的使用局限，个别有效化合物的作用靶点无法搜集全面，将在今后的研究中继续完善和深入研究验证。