李坤林 赵蕾

摘要：2021年4月，山东省博兴县某鸭场雏鸭发生一起以精神沉郁、发病急、病程短、发病率和死亡率高为主要临床特征的疫病，根据临床和实验室诊断结果确诊为基因C型鸭甲肝病毒和荚膜A型多杀性巴氏杆菌混合感染，为及时准确采取针对性治疗措施提供了参考。

关键词：雏鸭;鸭甲肝病毒;多杀性巴氏杆菌;混合感染;诊断

鸭病毒性肝炎是雏鸭的一种急性、致死性传染病，具有传播快、病程短、发病急、病死率高等流行特点，其主要致病原为鸭甲肝病毒，以3周龄内雏鸭易感，且雏鸭日龄越小，死亡率越高，是当前危害雏鸭健康最严重的传染病[1]。鸭巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的一种急性、败血性、高度接触性传染病，该病在我国鸭群中的流行较为普遍，每年都给我国养鸭产业造成巨大的经济损失[2]。鸭甲肝病毒和多杀性巴氏杆菌均是当前威胁鸭群健康的主要疫病，2021年4月，山东省博兴县某鸭场雏鸭发生一起疑似鸭甲肝病毒和多杀性巴氏杆菌混合感染病例，现将整个诊断过程汇报如下。

1 发病情况

2021年4月初，该鸭场饲养的7日龄肉鸭开始发病，发病雏鸭食欲下降、精神沉郁，发病急，发病率在80%以上，病程短，发病后48h内死亡，刚开始发病时死亡率较低，但发病后期死亡率较高，整体死亡率在60%以上。

2 临床症状

发病雏鸭精神沉郁，食欲废绝，羽毛松乱，摇头，喜卧，死亡前大多数会发生抽搐，表现出明显的神经症状，死后呈角弓反张姿势。

3 剖检特征

解剖死亡雏鸭可见肝脏肿大、有出血点和出血斑、表面具有白色黏膜，脾脏肿大、坏死，肾脏肿大、有出血点，心内外膜斑点状出血，肺脏水肿、出血。无菌采集死亡雏鸭的肝脏、脾脏作为临床病料样品，在实验室进行病毒PCR检测和细菌分离鉴定。

4 病毒PCR检测

4.1 设计合成引物

参照黄秋雪等[3]建立的基因A型和C型鸭甲肝病毒双重RT-PCR鉴别检测方法分别设计合成基因A型和C型鸭甲肝病毒特异性检测引物（引物信息如表1所示）。

4.2 一步法RT-PCR扩增

按照病毒基因组RNA提取试剂盒（购自北京百泰克生物科技有限公司）使用说明书提取临床病料样品的基因组RNA，利用设计合成的鉴别检测引物对提取的病料样品基因组RNA进行一步法RT-PCR扩增。一步法RT-PCR扩增体系为：2×One step Buffer 12.5μL、One step Enzyme Mix 0.5μL、引物F1/R1/F2/R2各0.5μL、RNA 4.0μL、H2O 6.0μL。一步法RT-PCR扩增程序为：50℃ 30min;95℃ 5min;95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环;72℃ 10min。一步法RT-PCR扩增结束后，取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，扩增产物在194bp处具有一条特异性扩增条带，与基因C型鸭甲肝病毒预期扩增片段大小一致，表明临床病例为基因C型鸭甲肝病毒阳性。

5 细菌分离鉴定

5.1 细菌分离培养

将无菌采集死亡雏鸭的肝脏、脾脏等临床病料样品划线接种于鲜血琼脂平板，37℃培养24h后，血平板上生长出边缘整齐、表面光滑、圆形隆起、灰白色、露珠状的单菌落，将单菌落涂片、革兰氏染色、镜检可见革兰氏阴性菌、短杆状，符合多杀性巴氏杆菌的培养特征。

5.2 生化鉴定试验

对分离菌株进行常规生化鉴定试验，结果表明分离菌株能够发酵蔗糖、葡萄糖、果糖，不能发酵麦芽糖、乳糖、鼠李糖，氧化酶、吲哚试验均为阳性，甲基红、硫化氢试验均为阴性，符合多杀性巴氏杆菌的生化特性。

5.3 荚膜基因型鉴定试验

5.3.1 设计合成引物 参照Townsend K M等[4]建立的多杀性巴氏杆菌不同荚膜基因型多重PCR鉴别检测方法分别设计合成荚膜A型、B型、D型、E型、F型特异性检测引物（引物信息如表2所示）。

5.3.2 PCR扩增 按照细菌基因组DNA提取试剂盒（购自北京百泰克生物科技有限公司）使用说明书提取分离菌株的基因组DNA，利用设计合成的鉴别检测引物对提取的DNA进行PCR扩增。PCR擴增体系为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL、DNA 4μL、引物F3/R3/F4/R4/F5/R5/F6/R6/F7/R7各0.5μL、水3.5μL。PCR扩增条件为：95℃ 5min;95℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 45s，30个循环;72℃ 10min。PCR扩增结束后，取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，扩增产物在1，044bp处具有一条特异性扩增条带，与荚膜A型多杀性巴氏杆菌预期扩增片段大小一致，表明分离菌株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌。

6 综合诊断结果

根据发病情况、临床症状、剖检特征等临床诊断结果和病毒PCR检测、细菌分离鉴定等实验室诊断结果，综合判定临床病例为基因C型鸭甲肝病毒和荚膜A型多杀性巴氏杆菌混合感染。

7 讨论

鸭甲肝病毒具有三种基因型（A型、B型和C型），各基因型之间无交叉保护作用，基因A型为我国传统的流行毒株，基因B型为2007年开始出现的新毒株，我国内陆地区尚未发现基因B型的流行。过去我国鸭甲肝病毒的流行优势基因型为A型，但近年来随着基因A型疫苗和卵黄抗体的广泛应用，A型的发病率逐步降低，但由于基因A型疫苗和卵黄抗体无法保护基因C型的感染，导致近年来基因C型的发病率迅速增加，管飘萍等[5]采用PCR方法对从山东省分离出的22株鸭甲肝病毒进行了基因分型，基因A型占36.36%（8/22），基因C型占63.63%（14/22）。本研究采用RT-PCR方法对临床病例进行了基因分型检测，结果显示为基因C型，与管飘萍等[5]的研究结果表现出了一致性，说明当前山东地区鸭群中流行的鸭甲肝病毒以基因C型为主要流行基因型，以预防基因A型为主的防控措施已不能满足临床疫病的防控需要，应逐步加强基因C型的防控。

根据多杀性巴氏杆菌荚膜抗原不同，将其分为5个荚膜基因型（A型、B型、D型、E型、F型），我国主要流行A型、B型、D型。Townsend K M等[4]通过比较分析多杀性巴氏杆菌荚膜基因特异性位点，建立了检测多杀性巴氏杆菌荚膜分型的多重PCR鉴别检测方法，该方法操作简单、准确、快速，在多杀性巴氏杆菌基因型分析中得到了广泛应用。仇桂玲等[6]采用多重PCR方法对20株禽源多杀性巴氏杆菌进行了荚膜基因型分型，荚膜A型为18株，占90%。本研究采用多重PCR方法对临床病例进行了基因分型检测，结果显示为荚膜基因A型，与仇桂玲等[6]的研究结果表现出了一致性，说明当前我国禽源多杀性巴氏杆菌的流行菌株以荚膜A型为主要基因型，临床应合理选择和使用疫苗，确保疫苗的免疫效果。

混合感染病例不仅使疫病的危害程度加剧，经济损失增加，也使疫病的诊断和治疗更加困难。由于混合感染病例的临床症状十分复杂，仅通过临床诊断很难确诊致病原，一般均需要借助实验室诊断方法。PCR方法作为最常用的分子生物学检测技术，能够检测到不同基因型致病原的特异性核苷酸序列，具有常规免疫学检测技术无法比拟的准确性，故本病例采用PCR技术分别对病毒和细菌均进行了分子水平上的鉴定，使诊断结果准确可靠。总之，本研究综合临床和实验室诊断结果判定为此次疫病由基因C型鸭甲肝病毒和荚膜A型多杀性巴氏杆菌两种致病原混合感染所致，但尚不能确定是哪种致病原在雏鸭发病过程中起主导作用，推测有两种可能，一种可能是雏鸭先感染了鸭甲肝病毒，导致雏鸭抵抗力降低，此时环境中的条件性致病菌（多杀性巴氏杆菌）迅速生长繁殖，加剧了疫病危害程度，使发病率和死亡率增加;另一种可能是雏鸭先感染了多杀性巴氏杆菌，导致雏鸭体质下降，引起鸭甲肝病毒的感染。无论是哪种可能，都与鸭场的日常饲养管理和生物安全防控技术密切相关，本次疫病发生的鸭场为连续饲养多年的老场，场内致病原逐年累积，一旦鸭群受到环境应激（如温差较大、多雨潮湿、惊吓、疫苗免疫等），鸭群免疫力下降后就会增加致病原混合感染的风险。故只有加强日常饲养管理和生物安全防控措施，使鸭群保持健康体质，才能有效避免混合感染的发生。

参考文献：

[1] 张大丙.鸭甲肝病毒的分子生物学研究进展[J].中国兽医杂志，2010，46（3）：59-61.

[2] 李润楠.一株由鸭头分离的巴氏杆菌鉴定与分析[J].中国动物保健，2020，22（10）：82+84.

[3] 黄秋雪，汤承，聂培婷，等. 鸭甲肝病毒基因A型和C型双重RT-PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2012，34（2）：120-123.

[4] Townsend K M， Boyce J D， Chung J Y， et al. Genetic organization of Pasteurella multocida cap Loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J]. J Clin Microbiol， 2001， 39（3）： 924-929.

[5] 管飄萍，Enkhbayar Munkhbayar，黄紫贝，等. 22株鸭甲型肝炎病毒的分离鉴定及其VP1基因的序列分析[J]. 中国家禽，2021，43（1）：105-109.

[6] 仇桂玲，钟嘉诚，谭结敏，等.20株禽多杀性巴氏杆菌的分离及荚膜与脂多糖的分型鉴定[J].广东畜牧兽医科技，2021，46（1）：43-49+52.

作者简介：李坤林（1976— ），山东成武人，助理研究员，本科，主要从事动物营养与动物疫苗研制工作，E-mail：15865218222@163.com

通讯作者：赵蕾（1977— ），副研究员，主要从事预防兽医学研究工作，E-mail：zhaolei77718@163.com