罗戈雯，何 杰，张 维

（成都医学院临床医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科，四川 成都 610500）

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种以成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积为病理特征的慢性肺部疾病，对于其发病机制目前没有统一定论[1，2]。IPF 起病较为隐匿，呼吸困难或者肺泡炎是其早期主要表现，患者若出现了肺功能改变和影像学征象变化时，说明已经进展到疾病的中晚期，最终导致治疗效果差，患者生存期短[3，4]。早期诊断和治疗并加以动态评估，对于提高IPF 患者生活质量、延缓病程具有重要的意义[5]。研究报道显示，炎症和免疫效应细胞可以进入肺内并过度释放肺内活性介质，促进细胞外基质沉积和肺成纤维细胞的增殖；同时肺部自噬水平的不足，肺泡上皮细胞产生上皮-间质效应，进一步加重了肺纤维化过程[6-9]。近年来，生物信息技术逐渐运用于呼吸系统疾病的靶基因筛选和机制的研究。因此，本研究通过生物信息分析技术筛选出GSE53845[10]、GSE24206[11]、GSE10667[12]三个IPF 基因芯片数据集中的自噬相关基因，通过检测筛选出的自噬基因在IPF 患者支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和血清中的表达量，分析其与患者肺功能、呼吸困难评分以及肺泡灌洗液中巨噬细胞计数等指标的相关关系，探讨自噬基因在特发性肺纤维化诊断及疾病评估方面的临床价值，为临床治疗提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源 从GEO 数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下载基因芯片数据集GSE24206、GSE10667 以及GSE53845。其中GSE24206 包含有IPF 肺组织标本17 个和正常肺组织标本6 个，GSE10667 包含有IPF 肺组织标本31 个和正常肺组织标本15 个，GSE53845 包含有IPF 肺组织标本40个和正常肺组织标本8 个。从人类自噬基因数据库（HADb，http://www.autophagy.lu/）中获取总的自噬相关基因数目222 个。

1.2 确定差异表达的自噬相关基因 使用R 软件中的limma 包筛选（筛选条件为|logFC|＞2；adj.P.Value＜0.05）差异表达的基因，并与人类自噬基因数据库中的自噬相关基因取交集。

1.3 研究对象 选取2018 年1 月-2020 年3 月于成都医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科就诊的74 例IPF 患者作为IPF 组，30 例常规体检的健康者作为对照组。IPF 组男性52 例，女性22 例，病程8个月～4 年，平均病程（12.42±0.44）月，年龄49～62岁，平均年龄（55.64±5.82）岁。纳入标准：符合2018年的美国胸科学会（ATS）/欧洲呼吸学会（ERS）的IPF 诊断标准[13]：①除外已知原因引起的间质性肺疾病如药物毒性作用、职业环境暴露、风湿免疫系统疾病等；②胸部HRCT 提示为普通间质性肺炎表现；③经纤支镜活检或支气管肺泡灌洗检查后排除其他疾病。排除标准：①合并其他严重肺部疾病；②合并严重心脑血管疾病；③合并风湿免疫性疾病或恶性肿瘤、职业暴露等引起的肺间质纤维化；④具有明确病因所导致的呼吸困难和肺功能检查结果的异常。对照组男15 例，女15 例，年龄50～58 岁，平均年龄（54.52±2.83）岁。对照组既往无呼吸系统相关的慢性疾病，近期肺功能及胸部CT 均无明显异常，也无呼吸道感染症状。本研究通过成都医学院第一附属医院伦理委员会讨论同意，伦理号20180124B，所有研究对象均充分了解实验目的及作用，并分别签署知情同意书。

1.4 方法 支气管肺泡灌洗与血清采样：患者经常规局部麻醉后行纤支镜检查，选择左肺舌叶或右肺中叶进行支气管肺泡灌洗，在选定的肺叶开口处注入100 ml 温度为35 ℃的生理盐水，将BALF 回收至收集瓶中，回收率＞35%，收集BALF 后立即进行静脉采血5 ml。BALF 经无菌纱布过滤以后注入离心管中，在4 ℃环境以1200 r/min 的速度离心10 min，取上清液注入无菌透析袋10 倍浓缩，再浸入到50%聚乙二醇溶液中10 倍浓缩，24 h 后加入生理盐水，取浓缩液置于-80 ℃冰箱保存以备用。检测时提取原液体积的10%复溶，沉淀物经细胞学检测，检测的试验方法参考《中华医学会呼吸分会支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范（草案）》[14]。静脉采样血液经离心后，取上清液于-80 ℃冰箱保存备用，将所有患者的血清和灌洗液收集齐后一次性检测。

1.5 观察指标

1.5.1 BALF 和血清中的NAMPT 水平检测 采用双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法检测两组研究对象血清和BALF 中NAMPT 水平，试剂盒由上海酶联生物科技有限公司（编号：TMl060212）提供。用标准曲线计算NAMPT 的浓度（ng/ml）。

1.5.2 肺功能检查 记录用力肺活量（FVC）、一氧化碳弥散量占预计值百分比（DLCO%）、第一秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV1%）。

1.5.3 呼吸困难评分测定 纳入的IPF 患者均参照改良英国医学研究委员会呼吸困难量表评分（mMRC）[15，16]评估呼吸困难程度，见表1。

表1 呼吸困难评分（分）

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0 软件对所有数据进行统计学分析，计量资料采用（）表示，组间比较采用t检验；线性相关性分析采用Pearson 法，以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息分析结果 GSE53845 筛选出差异基因92 个、GSE24206 筛选出差异基因51 个、GSE10667筛选出差异基因134 个，见图1，三个数据集与自噬相关基因取交集筛选出1 个自噬相关基因NAMPT，见图2。

图1 三个数据集的热图

图2 自噬相关基因的韦恩图

2.2 两组BALF 和血清中NAMPT 水平比较 IPF 组患者BALF 中及血清中的NAMPT 水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组BALF 和血清中的NAMPT 水平比较（，ng/ml）

表2 两组BALF 和血清中的NAMPT 水平比较（，ng/ml）

2.3 两组细胞学总数及分类计数比较 IPF 组BALF中巨噬细胞百分数高于对照组，淋巴细胞百分数低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 两组细胞学总数及分类计数比较（）

表3 两组细胞学总数及分类计数比较（）

2.4 IPF 组BALF 和血清中NAMPT 水平与肺功能指标的相关性 IPF 组患者BALF 中NAMPT 水平与FEV1%、FVC 和DLCO%呈负相关（r=-0.687，-0.701，-0.622，P＜0.05）；血清中NAMPT 水平与DLCO%呈负相关（r=-0.414，P＜0.05）；IPF 组患者mMRC 评分为（2.90±1.32）分，患者BALF 和血清中的NAMPT 水平与mMRC 呈正相关（r=0.544，0.532，P＜0.05），见表4。

表4 IPF 组BALF 和血清中NAMPT 水平与肺功能指标的相关性

3 讨论

IPF 是间质性肺炎中的一种常见类型，起病隐匿且发病机制不清，主要临床症状缺乏特异性，表现为咳嗽、咳痰、呼吸困难，较容易与COPD、支气管扩张症、尘肺等其他呼吸系统慢性疾病相混淆[17]。然而，IPF 一旦出现了典型的影像学改变或者肺功能检查提示有限制性通气功能障碍，说明疾病已经进展到了中晚期[18]。由于缺乏有效的IPF 药物治疗，大多数患者确诊后的中位生存期仅为2.5～4 年，预后极差[19]。目前临床上通常采用临床表现、影像学评估以及肺功能检测等方法对IPF 进行疾病诊断和预后评估，但是上述方法的敏感性和特异性均不高，而且评价项目过于繁多复杂，在诊断的过程中很容易受到临床医生存在的主观因素的干扰，最终降低了对于IPF 诊断的准确性[20]。肺组织病理活检虽然是诊断IPF 病情进展的金标准，但获取肺组织的方式通常采用开胸肺活检或者冷冻肺活检，这种有创性操作技术难度大，风险高，在基层医院难以广泛开展。因此，积极寻求一种简便的IPF 相关血清生物标志物显得十分重要。

IPF 预防和治疗的理论基础来自该病的发病机制，国内外许多研究从信号转导机制、氧化应激、细胞自噬、炎症因子等多个方面探究了IPF 的发病机制，虽然未完全揭露IPF 的病因，但是深刻了对IPF疾病的认识，尤其在细胞自噬领域开展了一系列对于IPF 机制的研究[21]。Sosulski ML 等[22]通过构建肺纤维化模型发现，模型中泛素化蛋白水平和多功能蛋白p62 水平高于对照组；通过直观的细胞电镜对肺纤维化模型进行观测发现模型中自噬体数量明显减少，这些现象均提示了肺纤维化过程中肺内伴有明显的自噬不足。细胞自噬在一个适度的水平可以保持肺组织细胞活性和维持内环境的稳定，然而在肺纤维化形成的过程中细胞的应激反应导致了细胞自噬功能的失调。Romero Y 等[23]研究指出，IPF 中的肺成纤维细胞显示出持续的mTOR 通路激活，而该通路对自噬有抑制作用，激活的mTOR 信号通路导致自噬水平明显不足，促进了肌成纤维细胞的分化，最终导致肺纤维化的形成。本研究通过生物信息分析技术筛查IPF 相关的自噬基因发现，在GSE53845、GSE24206、GSE10667 三个IPF 相关数据集中，自噬基因NAMPT 都存在着过表达，NAMPT同时也是哺乳动物细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成通路的限速酶，参与了调节细胞内重要的病理生理过程，在细胞自噬过程中，NAMPT 可以合成NAD，激活去乙酰化酶SIRT1 和PARP，从而抑制细胞自噬，促进成纤维细胞增殖；被释放到细胞外的NAMPT 还与其他炎症因子存在一定的交互作用，一方面炎症因子如白介素-1、TNF-α、TGF-β 能刺激NAMPT 释放，另一方面NAMPT 也能显著上调白介素-1、TNF-α、TGF-β 等细胞因子的表达[24，25]。因此，NAMPT 所具有的调节免疫和抑制细胞自噬的功能在IPF 的机制中可能发挥着重要作用。

为了进一步验证生物信息分析结果，本研究比较了IPF 患者和健康对照者的BALF 和血清中NAMPT 水平、BALF 中的细胞计数及肺功能结果，发现两组检测结果的差异具有统计学意义（P＜0.05）；将IPF 患者血清及BALF 中的NAMPT 水平与肺功能和mMRC 评分进行相关性分析，发现IPF组患者BALF 中NAMPT 水平与FEV1%、FVC 呈负相关；血清中NAMPT 水平中的NAMPT 与DLCO%也呈负相关，IPF 组患者BALF 和血清中的NAMPT水平与mMRC 呈正相关，提示肺功能越差的IPF 患者其血清和肺泡灌洗液中的NAMPT 水平越高，分析其原因可能与NAMPT 过表达导致肺泡上皮细胞自噬功能下降，肺成纤维细胞过度增殖有关。由此可见，血清和BALF 中NAMPT 水平可作为评估IPF病情严重程度的一个可靠指标。而血清和BALF 的测定具有简便性和可重复性，可用于临床监测IPF患者病情变化。本研究也有一定局限性，由于纳入研究的病例数较少，随访时间太短，未对患者的生存预后与NAMPT 的关系进行更深入的探索，因此在今后的研究中，本课题组将扩大样本量和延长随访时间，以期对本研究结果进行更进一步的确认。

综上所述，IPF 患者BALF 和血清中NAMPT 水平明显升高，且与患者肺功能和呼吸困难评分显著相关，有助于对IPF 患者的病情状况进行长期动态评估。