史学丽，高辉，周永红，赵伟

摘要：為了灵敏、特异地测定牛奶中17β-雌二醇（E2）的含量，解决传统方法测定时因原位激发导致的荧光背景干扰、样品预处理复杂等问题，基于荧光共振能量转移（FRET）原理，结合适配体与靶标的特异性识别，建立一种基于荧光适配体传感器的E2定量分析方法。采用水热合成法制备铕（Eu3+）掺杂的镓酸锌长余辉纳米粒子，并将E2适配体修饰到纳米粒子（PLNP）上，形成复合物（PLNP-Aptamer）。以PLNP-Aptamer为能量供体，以二硫化钼纳米片为能量受体，根据荧光强度与靶标17β-雌二醇之间的线性关系实现对E2的检测，并对检测条件进行优化。结果表明，当PLNP-Aptamer、二硫化钼的质量浓度分别为0.1，0.8 mg/mL，E2与适配体的孵育时间为20 min，pH值为7.0时，雌二醇的线性检测范围为0.6～80 ng/mL，检出限为0.4 ng/mL。通过加标回收实验，证明检测体系对17β-雌二醇具有显著的选择性，可用于实际样品的检测。所提方法解决了样品预处理复杂耗时，乳基质荧光干扰等问题，可为基层卫生监督工作提供一种简单、高效、成本低廉的雌激素检测方法，对其他环境雌激素的检测也具有参考价值和借鉴意义。

关键词：应用生物化学;荧光;纳米传感器;二硫化钼;镓酸锌

中图分类号：R926文献标识码：ADOI： 10.7535/hbgykj.2021yx05005

A quantitative analysis method for 17β-estradiol based on aptasensor

SHI Xueli1，GAO Hui1，ZHOU Yonghong1，ZHAO Wei2

（1.Shijiazhuang Maternity and Child Healthcare Hospital，Shijiazhuang，Hebei 050051，China;2.Shijiazhuang Center for Disease Control and Prevention，Shijiazhuang，Hebei 050019，China）

Abstract：In order to determine the content of 17β-estradiol （E2） in milk sensitively and specifically，and solve the problems such as the interference of fluorescence background caused by in-situ excitation and the complexity of sample pretreatment in the traditional method，a quantitative analysis method for 17β-estradiol based on fluorescence aptasensor was constructed on grounds of the fluorescence resonance energy transfer （FRET），combined with the specificity of the aptamer and target recognition.Persistent luminescence nanoparticles （PLNP） doped with Eu3+ were prepared by the hydrothermal method and modified with E2 aptamers onto PLNP to form the coupling complex PLNP-Aptamer.In this method，PLNP-Aptamer was used as energy donor.MoS2 was used as the acceptor.According to the linear relationship between phosphorescent intensity and target E2，the content of E2 was detected，and the detection conditions were optimized.The results show that when the concentrations of PLNP-Aptamer and MoS2 are 0.1 mg/mL and 0.8 mg/mL respectively，the reaction time of E2 and aptamer is 20 min，pH is 7.0，the linear detection scope of E2 concentration is from 0.6 ng/mL to 80 ng/mL and the detection limit is 0.4 ng/mL.The adding standard recovery experiment proves that the detection system has high specificity to E2，and can realize quantitative detection of E2 in actual samples.The method provides a simple，efficient and low-cost estrogen detection method for grass-roots health supervision by solving the problem of the complicated time-consuming of sample pretreatment and avoiding the fluorescence interference of milk matrix.It also provides a reference for other environmental estrogens detection.

Keywords：applied biochemistry;fluorescence;nanosensor;MoS2;ZnGa2O4

17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）是一种具有内分泌干扰效应的内源性雌激素，过量摄入可严重干扰内分泌系统[1-2]。目前，在多种水源、食物中均检测出E2[3-6]。虽然含量低，但可通过生物放大效应引起体内富集，具有较强的生物蓄积毒性。为保障食品安全，建立食品中E2的实时监测意义重大。常用的E2检测方法有色谱法[7-8]、免疫学方法[9]和适配体传感法[10-11]等。

适配体是经体外筛选得到的一段能与配体高亲和力特异性结合的寡核苷酸序列，相对于以抗体作为生物识别分子的生物传感器[12-13]，适配体易于修饰，稳定性高，对目标物具有极好的选择性[14]，为分析识别配基提供了更好的选择，且基于核酸适配体的生物传感器在检测领域应用前景广阔[15-16]。荧光传感器已应用在多种食品检测中[17-19]。然而，大多数荧光检测都是在可见光范围内基于荧光猝灭模式进行，其抗干扰能力较差，定量范围比较窄，尤其对于牛奶这种复杂样品的检测，其无法避免原位激发导致的脂质自体荧光等背景噪音的干扰。

随着分析化学及材料科学的迅速发展，以长余辉纳米粒子（PLNPs）为基础的纳米探针成为生物分析和生物成像的新一代光学探针[20-23]，可以在没有进一步激发的情况下，持续数小时发光[24]，并可重复利用，能有效避免原位激发产生的背景干扰，很大程度上增加了检测的灵敏度及信噪比。稀土离子是发光材料中应用最广的一类激活剂，由于荧光效率高、荧光谱带窄而被广泛应用于PLNPs的制备中。铕（Eu3+）离子作为激活剂掺杂到各种基质中，通过改变缺陷的深度和密度，使PLNPs余辉强度和余辉时间都普遍提高[25-26]。

因此，笔者基于荧光共振能量转移（FRET）原理，通过水热合成法制备了铕掺杂的镓酸锌长余辉纳米粒子ZnGa2O4：Eu3+，将PLNP-Aptamer（适配体修饰的长余辉纳米粒子）作为FRET供体，MoS2纳米片为受体，结合适配体与靶标的特异性识别，构建了一种灵敏、特异的E2定量分析方法，有效避免了牛奶基质等因素产生的背景干扰。

1主要材料与仪器

1.1药品与试剂

实验所用的试剂均为分析纯。硝酸锌（Zn（NO3）2·6H2O）、氧化镓（Ga2O3）、氧化铕（Eu2O3）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、三羥甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）、4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo-SMCC）、双酚A（BPA）、孕酮（PRG）、己烯雌酚（DES）、雌三醇（E3）和17β-雌二醇（E2），均由上海阿拉丁生物技术有限公司提供;二硫化钼纳米片（MoS2），江苏先丰纳米材料科技有限公司提供;3%（体积分数，下同）冰醋酸、二甲基甲酰（DMF）和氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司提供。E2适配体序列：（5′-SH-GCT-TCC-AGC-TTA-TTG-AAT-TAC-ACG-CAG-AGG-GTA-GCG-GCT-CTG-CGC-ATT-CAA-TTG-CTG-CGC-GCT-GAA-GCG-CGG-AAG-C-3′），上海生工生物工程有限公司提供;牛奶，购于本地超市。

1.2仪器

JEM-2100透射电子显微镜、F-7000荧光分光光度计、SU8010扫描电子显微镜，日本日立公司提供;X-射线衍射仪，Zeta电位分析仪，德国布鲁克公司提供;IS10傅里叶变化红外光谱仪，美国热电公司提供;恒温加热磁力搅拌器，山东甄城华鲁电热仪器有限公司提供;KQ-100DB型数控超声波清洗仪器，昆山市超声仪器有限公司提供;BSA124S电子天平，ST3100实验室pH计，奥豪斯仪器有限公司提供。

2试验方法

2.1E2的检测原理

荧光共振能量转移（FRET）技术是指荧光供体的发射光谱与受体的吸收光谱存在重叠，当能量供体和能量受体之间的距离小于10 nm时，供体和受体之间发生荧光共振能量转移。因此，可以利用供-受体距离变化导致的荧光强度变化来反映分析物的含量。基于FRET的E2检测原理如图1所示。经氨基修饰的PLNPS标记E2适配体，形成PLNP-Aptamer作为能量供体，选择MoS2纳米片作为受体，PLNP-Aptamer吸附在MoS2表面而形成FRET体系，PLNP-Aptamer的荧光被猝灭;当体系中存在E2时，E2与适配体标记的PLNP-Aptamer特异性结合，从而破坏PLNP-Aptamer与MoS2之间荧光共振能量转移体系，使PLNP-Aptamer的荧光恢复，荧光强度与E2的浓度呈线性关系，据此实现对E2的检测。

2.2PLNPs的制备与修饰

长余辉纳米粒子（ZnGa2O4：Eu3+PLNPs）的制备：采用水热法合成PLNPs[25，27]，首先按照ω（Zn）∶ω（Ga）∶ω（Eu）=1∶1.999∶0.001的化学计量比取适量Zn（NO3）2·6H2O和Ga2O3粉末混合，然后加入Eu2O3粉末，快速搅拌下缓慢滴加NaOH溶液，调节pH值至12，将混合溶液转移至聚四氟乙烯内衬的反应釜中，于210  ℃中反应72 h。反应完成后，将产物离心分离（10 000 r/min，5 min），弃去上清液。用超纯水和乙醇分别洗涤5次和3次，置于真空干燥箱中105 ℃干燥4 h。

羟基修饰的长余辉纳米粒子PLNP-OH的制备：取ZnGa2O4：Eu3+ PLNPs 400 mg，超声分散于80 mL的NaOH溶液（50 mmol/L），使其浓度为5 mg/mL，室温条件下搅拌24 h，然后离心分离，用超纯水洗涤3次，所得产物室温真空干燥24 h，备用。

氨基修饰的长余辉纳米粒子PLNP-NH2的制备：取250 mg PLNP-OH，超声分散至二甲基甲酰胺（DMF），浓度为2.5 mg/mL。搅拌下加入10 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），滴加完成后将反应体系置于80 ℃水浴中，搅拌下反应24 h，然后离心分离，用DMF洗涤3次，无水乙醇洗涤1次，所得产物真空干燥24 h，备用。

2.3氨基化纳米粒子与雌二醇适配体的偶联（PLNP-Aptamer）

称量1 mg PLNP-NH2和0.2 mg Sulfo-SMCC，加入到1 mL 的HEPES缓冲液（10 mmol/L，pH=7.2），混合均匀后在25 ℃下振荡30 min，使PLNPs表面修饰的氨基充分活化。离心收集活化的PLNPs-NH2， 用Tris-HCl缓冲液（10 mmol/L，pH=7.4）洗涤3次。然后将PLNPs-NH2加入含E2适配体（2 nmol/mL）的Tris-HCl缓冲溶液中，室温下充分孵育12 h，离心收集备用。

2.4标准溶液及牛奶样品的配置

配置不同浓度的E2标准储备液，溶剂为 Tris-HCl 缓冲溶液，备用。

10 mL本地市售牛奶样品加入3%冰醋酸，10 ℃离心（10 000 r/min，10 min），取上清液。处理后的牛奶样品用 Tris-HCl 缓冲溶液稀释，-4 ℃保存备用。

2.5E2标准曲线的制作

分别取 500 μL的PLNP-Aptamer（0.1 mg/mL）和500 μL的MoS2纳米片（0.8 mg/mL），混合均匀后37 ℃孵育15 min，后立即加入1 500 μL E2标准品溶液，混合均匀后37 ℃孵育15 min。使用荧光光谱仪测定样品荧光光谱，选取紫外吸收峰的最大波长254 nm为激发波长[28]，考察发射峰710 nm处的荧光强度，制作标准曲线。

3结果和讨论

3.1PLNP纳米粒子和MoS2纳米片的表征

1）PLNP纳米粒子的表征如图2、图3所示，透射电镜（TEM）的结果显示制备的纳米粒子颗粒均匀，粒径为10～20 nm （见图2 a））;对PLNP，PLNP-NH2，PLNP-Aptamer 进行X射线衍射表征，结果见图2 b），XRD谱图与ZnGa2O4的标准谱图一致，未出现非均相峰，说明合成的ZnGa2O4：Eu3+为尖晶石构型，纯净无杂质。氨基修饰后的PLNP-NH2，FT-IR光谱（见图2 c））可以看出波数为1 120 cm-1和1 040 cm-1的2个峰对应于O-Si-O的伸缩振动吸收峰，2 929 cm-1和2 872 cm-1处出现了不对称和对称的-CH2的伸缩振动吸收峰，说明在ZnGa2O4：Eu3+ PLNPs颗粒表面修饰上了-NH2。由ZnGa2O4：Eu3+纳米材料的发射光谱所示（见图3 a）），其在254 nm激发波长下，最大发射波长为710 nm，Stokes位移高达460 nm，充分说明合成的纳米材料背景干扰低、检测灵敏度高，适用于本实验的定量检测。

2）MoS2纳米片及其与PLNP-Aptamer复合物的表征由图3 a）粗线所示，MoS2占据UV-vis-NIR吸收谱，吸收光谱范围广，与PLNP-Aptamer的荧光发射光谱有很大的重叠交叉区域。基于FRET原理，PLNPs作为供体发射的荧光可以被MoS2受体吸收而发生荧光猝灭。此外，通过范德华力将带负电荷的适体功能化的PLNP-Aptamer吸附到MoS2纳米片上，进一步缩短了PLNPs与MoS2之间的距离，有效产生了FRET。

3.2检测条件的优化

1）MoS2用量的優化固定PLNP-Aptamer的MoS2质量浓度（下同）为0.5 mg/mL，加入不同浓度的MoS2，从而对其用量进行优化，将MoS2的浓度从0逐渐添加到1.0 mg/mL时，PLNP荧光强度在254 nm的激发下逐渐下降，当加入量为0.8 mg/mL时，体系的荧光淬灭强度进入平台期，荧光强度不再有明显变化;当加入量为1.0 mg/mL时，荧光强度的淬灭效率高于95%（见图3 b））。综合考虑光散射效应及荧光猝灭强度因素，本实验选择0.8 mg/mL作为随后检测中 MoS2的用量。

2）PLNP-Aptamer供体与MoS2受体孵育时间的优化随着孵育时间的增加，当孵育时间为15 min时，荧光猝灭几乎达到最大，PLNP-Aptamer供体与MoS2受体反应接近饱和（见图3 c）），图中I0代表只有PLNP-Aptamer时的荧光强度，I代表加入MoS2时PLNP-Aptamer的荧光强度。

3）FRET体系pH值的优化核酸适配体是一种具有特定空间构型的单链DNA，其空间构型对其与E2的结合能力有重要影响。pH值对单链 DNA 的三维空间结构有很大影响。因此笔者考察了pH 值对检测的影响。结果如图4所示，当 pH值为7.0时，在0.8 mg/mL MoS2纳米片中加入E2后，核酸适配体对E2的亲和力最强。因此，选择pH值7.0用于随后的检测。

4）E2与适配体的孵育时间的优化PLNP-Aptamer与MoS2发生荧光共振能量转移导致 PLNP-Aptamer 的荧光猝灭;而E2的加入会使得其适配体空间结构改变，使得PLNP-Aptamer与MoS2分离，PLNP-Aptamer的荧光得到恢复。为了达到最佳的荧光恢复效果，需对E2的孵育时间进行优化。随着孵育时间的增加，PLNP-Aptamer在710 nm处的荧光强度ΔI/I0不断增加。当孵育20 min时，荧光强度恢复到最大，之后基本保持不变（见图5），因此孵育时间选择为20 min。

3.3标准曲线

为考察该方法的灵敏度，测定其线性范围和检出限。在最佳条件下，将不同浓度（0.6～1 100 ng/mL）E2加入检测体系，考察710 nm处荧光强度的变化，分析定量范围。结果如图6所示，无E2时荧光发射强度最低，随着E2浓度增加体系荧光强度随之增强（见图6a））;采用线性拟合，雌二醇的线性检测范围为0.6～80 ng/mL，检出限为0.4 ng/mL（见图6 b））。

3.4特异性考察

为评价本方法对E2检测的特异性，选择E2结构类似物双酚A （BPA）、孕酮（PRG）、己烯雌酚（DES）、雌三醇（estriol）4种环境雌激素进行研究，分别测定了质量浓度均为50 ng/mL的E2和其他4种环境雌激素，以牛奶为空白样本做阴性对照。结果如图7所示，适配体对E2具有较高的亲和性，特异性结合使PLNP脱离MoS2表面，PLNP荧光恢复，发射强度大幅度增强。由于E2适配体强特异性，对E2的结构类似物双酚A、己烯雌酚、雌三醇进行测定时亲和力弱，不能引起PLNP-Aptamer脱离MoS2表面，荧光强度恢复不明显。以上结果表明，本文所建立的基于FRET的荧光传感器对E2具有良好的选择性。

4回收试验

为了考察E2检测方法的准确性和在实际牛奶样品检测中的分析能力，对牛奶样品进行加标回收试验。在牛奶样品中加入不同浓度的E2标准品，按本方法测定E2含量，结果如表1所示，回收率在91.2%～100.5%。试验结果表明，本文所建立的基于适配体的荧光传感器对E2实际样品的检测具有良好的准确性，可实现无色谱分离情况下对牛奶中E2的检测。

5结语

笔者基于FRET原理，采用水热合成法制备了铕掺杂的镓酸锌长余辉纳米粒子，并通过适配体与靶标E2的特异性结合构建了一种E2定量分析方法，主要結论如下。

1）实验合成的纳米粒子颗粒均匀，纯度高，与MoS2的荧光发射光谱有很大的重叠交叉区域，可实现FRET。

2）通过标记E2适配体的长余辉ZnGa2O4：Eu3+纳米粒子（PLNP-Aptamer）与MoS2纳米片，构建了荧光共振能量转移检测体系，结果表明当纳米粒子与雌二醇适配体的偶联复合物、二硫化钼质量浓度分别为0.1，0.8 mg/mL，孵育时间为20 min，pH值为7.0时，雌二醇的线性检测范围为0.6～80 ng/mL，检出限为0.4 ng/mL。该适配体传感器能够高灵敏度、高特异性地检测目标分子，并能够避免乳基质和类似物的荧光干扰。

3）特异性考察结果显示本研究建立的检测体系对E2的结构类似物双酚A、己烯雌酚、孕酮、雌三醇的亲和力弱，可在无色谱分离的情况下，实现对牛奶这类复杂样品中E2的高选择性定量检测。

4）加标回收试验显示牛奶样品的回收率为91.2%～100.5%，本法在实际样品检测中具有较好的准确性、稳定性和检测特异性，可以实现E2的灵敏检测。

本方法无需复杂的样本预处理，操作简单、快捷，可避免原位激发导致的荧光干扰，检测特异性高;同时适配体价格低、性质稳定，是一种简单、高效、成本低廉的雌激素检测方法。但该研究样本较为单一，今后将进一步扩大研究样本，建立更多食品样本中雌激素的检测方法，为健全食品安全标准体系提供参考借鉴。

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