张圭珍 霍巧玲 王继升 赵琦 李海松

摘要 目的：運用网络药理学的分析方法探讨淫羊藿-巴戟天治疗勃起功能障碍的潜在机制。方法：从中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、生物信息学分析工具BATMAN-TCM数据库筛选出淫羊藿、巴戟天的有效活性成分及作用靶点，运用GeneCards、OMIM、NCBI数据库获取勃起功能障碍的疾病靶点，韦恩图筛选药对、疾病的共同的靶点。采用String数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建，Cystoscap 3.7.2进行拓扑分析，构建药对中药-活性成分-疾病-靶点交集网络，运用R3.6.3软件对共同靶点进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，筛选出潜在信号通路并分析其作用机制。结果：1）巴戟天、淫羊藿筛选出203个靶点。2）勃起功能障碍疾病筛选出1 004个靶点。3）淫羊藿-巴戟天药对与勃起功能障碍的交集靶点共75个。4）通过PPI网络筛选出IL6、VEGFA、CASP3等30个关键靶点。5）GO分析的生物过程主要富集在对脂多糖的反应等过程;细胞组分主要富集在膜筏、膜微区等部位;分子功能主要富集在肾上腺素能受体活性等。6）KEGG分析共富集到PI3K-AKT信号通路等17条信号通路。结论：淫羊藿-巴戟天药对治疗勃起功能障碍，主要通过影响PI3K-AKT等信号通路发挥作用，同时可能与降低精氨酸酶、乙酰胆碱酯酶和腺苷脱氨酶的活性，上调NO水平，抑制PDE-5活性及影响细胞信号转导等机制相关。

关键词 网络药理学;淫羊藿;巴戟天;药对;勃起功能障碍;阳痿;靶点;PI3K-AKT通路

Mechanism Research of Epimedium-Morinda in Treating Erectile Dysfunction Based

on Network Pharmacological Method

ZHANG Guizhen，HUO QiaoLing，WANG Jisheng，ZHAO Qi，LI Haisong

（Dongzhimen Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To study the target and signal pathway of Epimedium-Morinda in the treatment of erectile dysfunction，and to explore the potential mechanism of Epimedium-Morinda in the treatment of erectile dysfunction.Methods：The active components and targets of epimedium-Morinda were screened out from TCMSP and BATMAN-TCM database，the disease targets of erectile dysfunction were obtained by Genecards，OMIM and NCBI gene human database，and the common targets of drugs and diseases were screened by venntu.The PPI network was constructed by using String database，and the topological analysis was carried out by using Cystoscap 3.7.2.The intersection network of traditional Chinese medicine，active ingredient，disease and target was constructed.The common target was analyzed by using R3.6.3 software for GO analysis and KEGG pathway enrichment analysis，and the potential signal pathway was screened and its mechanism was analyzed.Results：1）Morinda has 20 chemical constituents and 43 targets.Epimedium has 23 chemical constituents and 202 targets.After merging and deleting，203 targets are obtained.Effective ingredients include quercetin，kaempferol，sitosterol，luteolin，etc.2）1004 targets were selected for erectile dysfunction.3）There were 75 intersection targets of Epimedium-Morinda and erectile dysfunction.4）A total of 30 key targets such as IL6，VEGFA and CASP3 were selected through PPI network.5）The biological process of GO analysis was mainly concentrated in the reaction to lipopolysaccharide，the reaction to bacterial source molecules，the vascular reaction in the circulatory system，etc; the cell components were mainly concentrated in the membrane raft，membrane micro area，membrane area，presynaptic membrane and posterior membrane，etc; the molecular function was mainly concentrated in the activity of adrenergic receptor，G protein coupled amine receptor，cytokine activity，nuclear receptor，transcription factor activity，etc.6）KEGG analysis enriched 17 signaling pathways，including PI3K AKT signaling pathway，neuroactive ligand receptor interaction，calcium signaling pathway，NF kappa B signaling pathway，cytokine cytokine receptor interaction，HIF-1 signaling pathway，p53 signaling pathway，cGMP-PKG signaling pathway.Conclusion：Epimedium-Morinda plays an important role in the treatment of erectile dysfunction by affecting PI3K AKT and other signaling pathways，and may be related to the mechanisms of reducing the activities of arginase，acetylcholinesterase and adenosine deaminase，increasing the level of NO，inhibiting the activity of PDE-5 and affecting the cell signaling.

Keywords Network pharmacology; Epimedium; Morinda; Couplet medicinals; Erectile dysfunction; Impotence; Target; PI3K AKT signaling pathway

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.011

勃起功能障碍（Erectile Dysfunction，ED）是指阴茎不能达到或不能维持充分的勃起而进行满意的性交的一类疾病，病程在6个月以上[1]。ED是男性最常见性功能障碍之一，有流行病学研究表明，ED主要影响40岁以上的男性其发病率随年龄的增长而增高，70岁以上男性群体中发病率高50%以上[2]。ED的病因涉及多方面，如激素水平、神经、内分泌、血管、心理情绪状态等[3-4]。目前西医治疗ED主要选用PDE-5抑制剂，虽然该药治疗ED临床疗效尚可，但治疗成本相对较高，不良反应亦较明显。

ED在中医学属于“阳痿”范畴，中医学依据其整体观念及辨证论治的两大特点治疗阳痿有着自身不可替代的优势。阳痿发病以肾虚为本，治宜温补肾阳，巴戟天-淫羊藿为温肾强阳起痿之良药，但具体的作用机制尚不明確。网络药理学作为一种较为科学、新兴的研究方法，整合了系统生物学、网络分析、药理学等多学科技术，通过多靶点、多通路来探究药物与疾病的关联性，具有系统性及整体性的特点，与中医学整体观念相契合。因此，我们基于网络药理学挖掘淫羊藿-巴戟天治疗ED的有效活性成分、作用靶点和关键通路，并进一步探讨其治疗ED的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 筛选淫羊藿-巴戟天药对活性成分和潜在作用靶点

在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）和中药分子机制的生物信息学分析工具BATMAN-TCM中检索巴戟天，淫羊藿，收集其化学成分以及靶点信息，设定成分筛选条件为口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）>0.18[5]，筛选出有效活性成分及其作用靶点。

1.2 勃起功能障碍靶点筛选

以“Erectile Dysfunction”为关键词，在GeneCard（https：//www.genecards.org/）数据库和OMIM数据库（https：//www.omim.org/）和NCBI基因人类数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行检索。合并筛重后获得勃起功能障碍疾病的相关靶点。

1.3 药对-疾病共同靶点及网络构建

将筛选过的“淫羊藿-巴戟天”药对靶点和ED靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1绘制韦恩图并获取药对-疾病共同靶点，这些靶点基因可认为是“淫羊藿-巴戟天”药对治疗ED的潜在靶点。利用cytoscape软件构建药物-活性成分-靶点-疾病网络图。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建及拓扑分析

将获取到的药对-疾病共同靶点基因上传到STRING在线基因数据库（https：//string-db.org/），物种选择为人类（Homo sapiens），构建PPI网络。将PPI网络导入Cystoscap 3.7.2中，通过NetworkAnalyzer工具进行拓扑分析，以Degree，Betweenness centrality，average shortest path length 和closeness centrality这4个参数为参考标准，通过Degree排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶点。并利用软件内置插件MCODE，分析PPI网络，进行关键核心通路过程描述。

1.5 基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析

将“淫羊藿-巴戟天”药对治疗ED的潜在靶点基因导入R3.6.3软件进行GO、KEGG富集分析。GO功能分析主要用于描述基因靶点的功能，其中包括细胞功能、分子功能和生物功能。药对和ED共同靶点所富集的信号通路则可通过KEGG富集分析得到。GO和KEGG分析均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选淫羊藿-巴戟天药对活性成分和潜在作用靶点

巴戟天筛选出20个化学成分，43个靶点;淫羊藿筛选出23个化学成分，202个靶点。合并删重后，得到203个靶点。其中有效成分包括槲皮素、山柰酚、谷甾醇、木犀草素等。见表1。

2.2 勃起功能障碍疾病靶点筛选

经过检索，在OMIM数据库检索到80个相关的基因，在GeneCards数据库检索到926条相关基因，NCBI基因数据库得到87个基因，将这3个数据库的基因合并删重之后，得到1 004个勃起功能障碍相关基因。

2.3 药对-疾病共同靶点预测及网络构建

将筛选出的药对靶点与疾病靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1，得到75个共有靶点。见图1。药物与疾病的交集靶点共75个，即淫羊藿-巴戟天治疗ED的潜在靶点。为了更好的理解中药、成分与其相应靶点之间的复杂相互作用关系，以纳入的复方中药、对应的中药成分、治疗疾病以及作用靶点为基础，构建了中药-成分-疾病-靶点网络图。见图2。

2.4 PPI网络构建及拓扑分析

将疾病ED的靶点与药对淫羊藿-巴戟天的靶点进行合并取得交集，从而得到了75个药对治疗疾病的交集靶点。运用String数据库导入这75个靶点，其物种选择为“人”，得到PPI网络图。见图3。PPI网络图中共有节点75个，687条边，平均节点度18.3，其中节点表示靶标蛋白，边则代表蛋白和蛋白之间的关系。通过Degree排序，选取分值大于平均分18分的基因作为关键靶点，总共筛选出30个关键靶点，将这30个靶点使用R 3.6.3进行图片绘制。见图4。IL6、VEGFA、CASP3、CXCL8、IL1B、NOS3、CCL2、APP、ESR1、SERPINE1、ICAM1、CRP、CXCL10、IL2、VCAM1、IL4、HMOX1、MPO、CASP8、BCL2L1、IFNG、TGFB1、SELE、ACHE、SOD1、AR、CD40LG、F3、NOS2、OPRM1;结果表明以上这30个靶点可能是淫羊藿-巴戟天治疗ED的核心靶点基因，说明这些靶点基因可能在治疗勃起功能障碍中发挥着重要作用。

2.5 GO富集分析

将药物疾病共有靶点进行GO的生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞组分（CC）富集，引用DAVID数据库，将校正P值<0.05的项目进行筛选，总共富集到1 593条生物过程，80项分子功能相关，63项细胞组成相关。使用R 3.6.3进行柱状图（图5）和气泡图绘制（图6）。GO分析结果提示淫羊藿-巴戟天药对治疗勃起功能障碍的基因生物过程（BP）显著富集在对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、循环系统中的血管反应、对抗生素的反应、第二信使介导的信号转导、管径调节、血管大小的调节、血管直径的调节、管尺寸调节、G蛋白偶联受体信号途径，偶联环核苷酸第二信使等过程;细胞组分（CC）主要富集在膜筏、膜微区、膜区、突触前膜及后膜等部位;在分子功能（MF）主要富集在肾上腺素能受体活性、G蛋白偶联胺受体活性、细胞因子活性、核受体活性、转录因子活性等。

2.6 KEGG富集通路分析

将药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析，引用String数据库，将校正P值<0.05的项目进行筛选，总共富集到PI3K-AKT信号通路、神经活性配体受体相互作用、钙信号通路、核因子κB（NF-κB）信號通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、HIF-1信号通路、p53信号通路、cGMP-PKG信号通路等17条信号通路。见表2。其中PI3K-AKT信号通路为击中靶点最多的通路，具体靶点包括：CHRM1、CHRM2、BCL-2、CASP9、CDK2、IKBKB、VEGFA、BCL2L1、IL-6、IL-2、IL-4、NOS3、COL1A1、IGF-2，淫羊藿-巴戟天对ED的治疗作用可能是通过影响此通路而实现的。并将信号通路使用R 3.6.3进行柱状图（图7）和气泡图（图8）绘制。并绘制PI3K-AKT信号通路作用机制图（图9）。

3 讨论

随着年龄的增长，ED发病率逐渐升高，老龄是ED发病的重要因素。从肾论治阳痿理论来源于《黄帝内经》中“肾藏精”“足少阴之筋，起于小指之下……结于阴器”“肾者，作强之官，伎巧出焉”。《诸病源候论·卷四》：“肾开窍于阴，若劳伤于肾，肾虚不能荣于阴器，故痿弱也。”故治阳痿多用温阳补肾之品。《神农本草经》曰“淫羊藿主阴痿绝伤，茎中痛，利小便，益气力，强志”，淫羊藿主入肝肾二经，性辛甘而温，故甘温而温肾补阳，为起痿之要药;《神农本草经》曰“巴戟天主大风邪气，阴痿不起，强筋骨，安五脏，补中增志益气”，巴戟天性辛甘微温，入肝肾二经，温肾助阳、强筋健骨，主治命火不足、肾阳虚衰之阳痿、腰痛，为补肾助阳之良药。临床上常将两药合用治疗肾阳亏虚之阳痿[6]。

淫羊藿-巴戟天治疗ED的有效成分主要包括槲皮素、山柰酚、谷甾醇、木犀草素等。槲皮素与木樨草素是一种天然黄酮类化合物，目前已经发现它具有多重生物活性，如抗氧化、抗病毒、抗炎等作用[7]。研究表明槲皮素能降低精氨酸酶、乙酰胆碱酯酶和腺苷脱氨酶的活性，上调NO水平[8]。在阴茎勃起过程中，脂溶性的NO直接进入海绵体SMC内，激活鸟苷酸环化酶（cGMP），cGMP水平不断增加，并调节SMC细胞膜上Ca2+、K+等通道，进而SMC得到完全舒张，增加阴茎动脉血流量，大量血液进入海绵窦从而牵拉白膜使静脉回流受压以达到坚挺勃起[9]。槲皮素对体外培养的大鼠阴茎组织PDE5、精氨酸酶、AChE和ACE活性均有抑制作用[10]。Lines和Ono[11]报道槲皮素显著降低PDE-5体外活性。此外，槲皮素的抑制作用与其结构有关，槲皮素中碳-5和碳-7处的羟基增加了对PDE-5活性的抑制作用。黄酮类化合物对PDE-5活性的抑制作用将增加cGMP的水平，可能触发阴茎平滑肌松弛、动脉扩张和阴茎勃起[12]。有研究表明山柰酚可显著增加大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞的增殖[13]。和正常对照组勃起组织的40%～60%相比，ED患者勃起组织中的平滑肌含量仅占10%～36%，其中42.3%平滑肌细胞有显著的病理改变[14]。海绵体平滑肌数量减少，结缔组织数量增加可导致勃起功能障碍的发生。阴茎海绵体平滑肌在阴茎勃起过程中发挥着很重要的作用[15]。β-谷甾醇属于植物甾醇类，广泛存在于自然界中的各种植物油、坚果等植物种子中，也存在于某些植物药中。有研究通过性经验不足的成年雄性大鼠口服β-谷甾醇，研究结果表明与对照组大鼠相比显著改善勃起功能[16]。

在筛选的潜在靶点中，关键靶点分别是白细胞介素-6（IL-6）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、细胞凋亡蛋白-3（CASP3）。白细胞介素-6是一种功效广泛的多效性细胞因子。有报道显示ED患者血液中的IL-6表达异常[17]，其可诱导内皮细胞中的炎症基因转录并抑制内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达[18];eNOS作为阴茎勃起过程中的一种重要信号分子，ED的发生与其产生减少相关[19]。此外，阴茎海绵体平滑肌细胞（CSMCs）和上皮细胞（ECs）是勃起组织中的重要成分，CSMCs和ECs发生萎缩、纤维化和凋亡等变化时，会引起海绵体组织的充血异常而导致ED的发生[20-21]。有研究表明CSMCs和ECs中的IL-6表达增高[22]，这也说明炎症介质过表达可能会引起CSMCs的炎性损伤，从而其舒缩功能受限，以及增加ECs的通透性进而加重血管炎性病变，从而对勃起功能产生影响而导致ED发生。血管内皮生长因子（VEGF）是一种参与血管生成的细胞因子，它可以刺激生成NO，而NO也可能刺激产生VEGF。VEGF与NO之间的相互作用可能是通过缺氧、损伤等因素使血管平滑肌细胞、内皮细胞中VEGF的表达增加，而表达增加的VEGF通过自分泌或旁分泌的方式作用于内皮细胞，从而增加内皮细胞中NO的产生，增加的NO又反过来作用于缺氧的平滑肌细胞使VEGF的表达降低[23]。VEGF对ED的影响除了通过血管生成作用，还很可能是通过增加NOS的表达，以及升高NO水平、神经递质增高等作用来实现的[24]。细胞凋亡蛋白3（Caspase3）在血管平滑肌明显表达，是细胞凋亡过程的主要执行者，是各凋亡通路下游进行底物酶解的共同的关键蛋白酶[25]。研究显示，从糖尿病性ED大鼠阴茎平滑肌组织中Caspase3表达升高，介导了阴茎平滑肌细胞的凋亡[26]。

从结果可以得出，在PI3K-AKT信号通路中共涉及14个靶点，淫羊藿-巴戟天对ED是治疗作用可能主要是通过此通路实现的。PI3K-AKT信号通路的失调与多种人类疾病的发生和发展有关[27]，并在细胞生长、增殖、分化的细胞内信号转导中发挥关键的调节作用[28]。阴茎海绵体松弛是阴茎勃起机制中的一个重要因素;阴茎海绵体平滑肌细胞（CCSMCs）中的缝隙连接（GJs）使阴茎勃起期间快速兴奋和同步收缩[29]。在缺氧条件下，CCSMCs和血管内皮细胞上调血小板源性生长因子（PDGF），通过与PDGFR结合，激活PI3K/AKT信号通路，刺激p-AKT的表达。反过来，p-AKT诱导下游因子β-catenin的表达，后者调节Cx43在细胞核的表达，从而改变GJs的功能。GJs是一种六聚体，由围绕亲水通道的6个Cx单体组成。大多数未兴奋的阴茎平滑肌细胞经历了3个相互关联的阶段：自主神经控制的阴茎勃起、GJs调节的平滑肌细胞同步收缩和信号转导[30]。GJ结构的损伤可导致ED。PI3K-AKT信号通路与Cx43密切相关[31-32]。Cx43是CCSMC GJs的主要成分[33]，是人类中表达最广泛的Cx。Cx43由于其短暂的半衰期，在调节细胞间GJs方面发挥了关键作用[34]。ED患者CC中Cx43的表达和分布异常，提示Cx43与缺氧诱导ED密切相关[35]。

综上所述，淫羊藿-巴戟天药对治疗勃起功能障碍，主要通过影响PI3K-AKT等信号通路发挥作用，同时可能与降低精氨酸酶、乙酰胆碱酯酶和腺苷脱氨酶的活性，上调NO水平，抑制PDE-5活性及影响细胞信号转导等机制相关。运用网络药理学的这一新兴方法探究淫羊藿-巴戟天药对治疗ED的潜在作用机制，为临证治疗ED提供新思路和依据。本研究是对淫羊藿-巴戟天药对治疗ED的机制的初探，其具体作用机制仍需进一步研究证实。

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（2020-09-21收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81774320）

作者简介：张圭珍（1987.03—），男，博士研究生在读，住院医师，研究方向：中医男科学，E-mail：2865776671@qq.com

通信作者：李海松（1960.01—），男，博士，主任医师，研究方向：中医男科学，E-mail：1028bj@sina.com