南星羽，冯梓钊，费越越，余路，罗扬，许丹

摘要：【目的】制備Ⅱ型鲤疱疹病毒（CyHV-2）ORF6多克隆抗体，为深入探究ORF6在CyHV-2急性感染或潜伏感染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】利用MEGA 6.0、Adobe Illustrator CS6及BepiPred-2.0等在线软件分析CyHV-2的ORF6基因序列信息，采用PCR从CyHV-2基因组中扩增ORF6基因片段，将其连接至原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导和尿素洗涤纯化获得融合蛋白。以纯化的融合蛋白ORF6免疫健康Babl/c小鼠制备ORF6多克隆抗体，并通过Western blotting和间接免疫荧光技术鉴定ORF6多克隆抗体的特异性。【结果】CyHV-2的ORF6基因全长3003 bp，与CyHV-3和CyHV-1的ORF6氨基酸序列相似性均高于30.00%，其中与CyHV-3的相似性高达39.36%;其抗原表位最可能存在于第1～300位氨基酸序列中。将PCR扩增获得的ORF6基因片段连接至原核表达载体pET-28a可成功构建重组质粒pET-28a-ORF6，转化BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导4 h即获得融合蛋白ORF6;原核表达的融合蛋白ORF6主要以包涵体形式进行表达，其分子量为17.13 kD，经6 mol/L尿素洗涤纯化后的浓度为0.1 mg/mL。以纯化融合蛋白ORF6免疫Babl/c小鼠制备获得的ORF6多克隆抗体能特异性识别融合蛋白ORF6及CyHV-2感染的异育银鲫尾鳍细胞（GiCF）;利用制备的ORF6多克隆抗体对CyHV-2感染GiCF细胞进行间接免疫荧光分析，结果在CyHV-2感染GiCF细胞周围能观察到特异性绿色荧光，而在未感染CyHV-2的GiCF细胞周围未观察到特异性绿色荧光，进一步说明ORF6多克隆抗体可特异性识别CyHV-2。【结论】制备获得的ORF6多克隆抗体能与CyHV-2感染GiCF细胞发生特异性免疫反应，即可用于鉴定CyHV-2感染，为探究ORF6蛋白功能是否与CyHV-2潜伏感染相关打下了基础。

关键词： Ⅱ型鲤疱疹病毒（CyHV-2）;ORF6蛋……