康 芦，王德明

（1.湖南医药学院第一附属医院麻醉科，湖南 怀化 410021；2.南华大学附属第二医院麻醉科，湖南 衡阳 421001）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是由各种直接、间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞与毛细血管内皮细胞的损伤，而引起弥漫性肺间质水肿、肺泡水肿等损害肺功能的症状，最终可造成急性低氧性呼吸功能不全。有研究表明，ALI的发病机制复杂，主要归因于过度的炎症反应引起的肺组织破坏，而肺泡血管内皮细胞与肺成纤维细胞可合成p38分裂原激活蛋白激酶（p38MAPK），从而激活热休克蛋白27（HSP27），诱导炎性因子产生，损害肺部组织，且细胞因子相互介导的级联炎性反应能加重肺组织损伤[1-2]。右美托咪定属于一种高选择性肾上腺素受体激动剂，具有镇静、镇痛、催眠及抑制交感神经活性等作用[3]。为探究右美托咪定治疗ALI的作用机制，本研究将BABL/cJ小鼠作为试验对象，旨在探讨右美托咪定对脂多糖致ALI小鼠p38分裂原激活蛋白激酶（p38MAPK） - 热休克蛋白27（HSP27）通路与炎症反应的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 BABL/cJ小鼠，均为雌性，体质量14～16 g，平均（15.11±0.07） g；所选动物均由南华大学提供，动物合格证号：SYXK（湘）2020-0002。本实验方案已经湖南医药学院第一附属医院实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 仪器与设备 脂多糖（美国Sigma-Aldrich公司）；盐酸右美托咪定注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20090248，规格：2 mL∶200 μg）；酶联免疫试剂盒（Beyotime Biotechnology Co.，LTD，中国）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（北京华夏远洋科技有限公司）；ELC化学法显色系统（美国Thermo Fisher公司）；蛋白电泳仪、转膜槽、蛋白电泳槽（美国Bio-Rad公司）等。

1.2 方法选取30只BABL/cJ小鼠为试验对象，随机取10只小鼠作为空白对照组；剩余20只小鼠建立脂多糖致ALI小鼠动物模型，建模前常规禁食12 h，并于腹腔内注射脂多糖5 mg/kg，连续注射3 d，若小鼠出现呼吸急促、抱团取暖、口唇发钳或抓取时无力反抗状态时则表明建模成功[4]。将建模成功后的小鼠随机分为两组，模型对照组和右美托咪定组，各10只。空白对照组与模型对照组小鼠均腹腔注射0.9%的氯化钠溶液（0.1 mL）干预，而右美托咪定组小鼠于注射LPS前30 min腹腔注射右美托咪定0.1 mL。24 h后评估各组干预效果。

1.3 观察指标 ①对比3组小鼠干预后24 h的炎性因子水平。3组小鼠均于干预后24 h以颈椎脱臼法处死，取尾静脉血3 mL，以3 000 r/min的转速离心10 min分离血清，后放置在 -20 ℃冰箱中备用，采用酶联免疫吸附法测定3组小鼠的肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）水平。②干预后24 h进行肺组织苏木精 - 伊红（HE）染色[5]。小鼠处死后取肺部组织，放置在浓度为4%多聚甲醛中，固定病灶组织，常规石蜡包埋，后制备4 μm切片，并完成HE染色，于光学倒置显微镜下观察小鼠肺部组织变化情况，每只小鼠取切片5张，每张切片观察5个不同的视野；③对比3组小鼠干预后24 h肺损伤指标，根据小鼠HE染色，观察小鼠肺组织并进行肺损伤评分[6]，分值为0～16分，分数越高，肺部损伤越重，并取右肺上叶组织，分别称量其湿重与干重，其中左肺上叶清洗后称重为湿重，然后将其置于80℃的烤箱，烘烤48 h后测量干重，计算湿重与干重的比值。④对比3组小鼠干预后24 h的p38MAPK-HSP27通路蛋白表达情况。取3组小鼠部分左肺部组织，加入细胞裂解液后匀浆30 min，离心15 min后，提取肺部蛋白，利用蛋白质印迹法（Western blotting）[7]检测p38MAPK、HSP27蛋白表达情况，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取蛋白上样品50 μg，加入样缓冲液，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，取200 mA凝胶稳流转移至聚偏二氟乙烯膜上后，采用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液完成2 h封闭，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体，室温孵育1 h。TBST洗膜后，加入ECL发光液，采用凝胶成像系统报告。

1.4 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件处理数据，计量资料使用(±s )表示，采用t检验；多组间计量资料比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 炎性因子 右美托咪定组和模型对照组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均高于空白对照组，但右美托咪定组低于模型对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05），见表1。

表1 3组小鼠炎性因子比较（  ±s , pg/mL）

表1 3组小鼠炎性因子比较（  ±s , pg/mL）

注：与空白对照组比，*P<0.05；与模型对照组比，#P<0.05。TNF-α：肿瘤坏死因子 -α；IL-6：白介素 -6；IL-1β：白介素 -1β。

组别 例数 TNF-α IL-6 IL-1β空白对照组 10 84.34±12.13 33.27±4.34 58.32±6.41模型对照组 10 326.98±43.25* 174.34±14.98* 203.59±15.39*右美托咪定组 10 123.23±24.29*# 102.15±10.29*# 132.53±10.63*#F值 195.384 427.598 404.925 P值 <0.05 <0.05 <0.05

2.2 HE染色 HE染色结果显示，空白对照组肺组织变化不明显，且结构完整，肺泡腔清晰，未见炎症细胞浸润；模型对照组肺泡结构破坏严重，大量炎症细胞浸润；右美托咪定组显示肺泡结构破坏与出血程度较轻，见图1。

图1 HE染色结果（×100）

2.3 肺损伤指标 右美托咪定组和模型对照组小鼠肺损伤评分、W/D水平均高于空白对照组，但右美托咪定组低于模型对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05），见表2。

表2 3组小鼠肺损伤指标比较( ±s )

表2 3组小鼠肺损伤指标比较( ±s )

注：与空白对照组比，*P <0.05；与模型对照组比，#P < 0.05。W/D：湿重与干重比。

组别 例数 肺损伤评分(分) W/D空白对照组 10 1.91±0.32 3.28±0.43模型对照组 10 9.30±0.83* 7.22±0.81*右美托咪定组 10 4.61±0.49*# 4.97±0.73*#F值 406.720 85.313 P值 <0.05 <0.05

2.4 p38MAPK-HSP27通路蛋白表达情况 Western blotting法结果显示，模型对照组与右美托咪定组小鼠肺组织中p38MAPK、HSP27蛋白含量均高于空白对照组，但右美托咪定组低于模型对照组，见图2。

图2 p38MAPK-HSP27通路蛋白表达情况

3 讨论

ALI是临床常见的急危重症，与中性粒细胞的广泛浸润、炎症细胞的过度激活、促炎介质的过量产生有关，患者主要特征有急性肺心源性肺水肿、顽固性低氧血症等，其临床致死率较高，因此，寻求规范化、创新性药物是进一步改善ALI患者预后的重点。

右美托咪定是一种有效的α2肾上腺素受体激动剂，其具有高亲和力、半衰期较短的特点，具有一定的选择性，可发挥抗焦虑、镇静、镇痛及神经保护等作用，进而稳定血流动力学，缓解气管插管及手术应激反应，是临床重病监护治疗的常用药物[8]。血清TNF-α、IL-6、IL-1β是临床常见的炎性因子，其可通过HSP27通路活化而被诱导产生，从而介导ALI的发生。本研究通过对右美托咪定组小鼠进行右美托咪定干预，并对3组小鼠肺部进行HE染色，结果显示，右美托咪定组小鼠肺损伤评分、W/D及血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均低于模型对照组，但高于空白对照组；HE染色显示，空白对照组小鼠肺组织变化不明显，并具有完整结构，肺泡腔清晰，未见炎症细胞浸润变化；模型对照组小鼠肺泡结构破坏严重，大量炎症细胞浸润；右美托咪定组小鼠肺泡结构破坏与出血程度较轻，提示将右美托咪定用于脂多糖致ALI小鼠中可减轻小鼠机体的炎症反应，从而减轻肺泡结构的损害，保护肺功能。

研究表明，p-p38MAPK含量可随ALI炎症反应程度加重而逐渐增加；而MAPK是细胞内重要的信号系统，能调控细胞增生、分化、凋亡及基因表达，当p38MAPK磷酸化后，可调节下游的HSP27表达，进而加重ALI[9]。本研究通过Western blotting检测显示，模型对照组与右美托咪定组小鼠肺组织中p38MAPK、HSP27蛋白含量均高于空白对照组，但右美托咪定组低于模型对照组，提示右美托咪定能抑制脂多糖致ALI小鼠肺组织p38MAPK-HSP27通路蛋白表达，继而抑制机体炎性反应，达到治疗ALI的目的，可为ALI患者的临床治疗提供新的思路。

综上，右美托咪定用于脂多糖致ALI小鼠中可减轻小鼠机体的炎症反应，抑制p38MAPK-HSP27通路活化，保护肺功能，为ALI的临床治疗提供新思路，值得临床进一步研究。