尹宝英,张文娟,朱小甫,张 浩

(1.咸阳职业技术学院 畜牧兽医研究所 咸阳市动物疫病分子生物学诊断技术研究重点实验室，陕西 咸阳 712000; 2.陕西正大有限公司，陕西 咸阳 712000)

猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea, PED)是我国2010年以来阻碍养猪业健康稳定发展的主要疫病之一[1～2]。感染PED的猪只主要临床表现为呕吐、腹泻和脱水，PED病毒会引起初生哺乳仔猪脱水死亡，致死率可高达100%。另因腹泻造成的母猪发情异常、流产、仔猪残次率高等间接损失难以估算[3]。该病在全国各地呈暴发流行，近年发生的季节性越来越不明显，部分猪场呈间歇性发病。2018年对陕西部分规模化猪场送检的162份腹泻样品检测结果中PEDV的阳性检出率分别为16.04%[4]，对陕西省养猪业造成了巨大的经济损失。

PED目前的防控主要是通过给妊娠母猪接种疫苗，让仔猪通过初乳以被动免疫的方式获得抵抗力，但由于该病存在发病日龄早、混合感染、病毒的基因变异以及商品疫苗免疫效果不理想等诸多问题，市售商品苗并没有起到理想的防护效果，PED复发始终存在[5]。国外猪场在发生 PED 时，通常采用返饲技术，使猪群在短期内集中感染，刺激母猪产生抗PED病毒抗体[6～7]。本实验采用返饲制备高免血清对陕西某频发PED猪场进行防治的效果观察，旨在探索和筛选在临床上治疗猪流行性腹泻的最佳方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源和实验动物 病料来自咸阳地区养猪场3～7日龄发生PED初期的仔猪肠道样本。病猪表现精神不振，食欲差，呕吐，频频拉白色、黄白色或黄绿色水样稀粪，严重脱水；呕吐、脱水和死亡。样品在-80℃ 冰箱保存；昆白鼠20只；产前90 d妊娠母猪6头。

1.1.2 材料 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0(TaKaRa9766)、PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 (TaKaRa RR055B)、琼脂糖(AOBOX)均购自宝生物工程(大连)有限公司；PDEV ELISA抗体检测试剂盒(青岛捷世康)、50×TAE( 北京博奥拓达)、0.9% 生理盐水、双抗、LB 培养基等均为国产化学试剂。

1.1.3 引物设计 根据GenBank中公布的PEDV毒株全基因序列( 登录号为 AF353511)，通过Premier 5.0软件设计，5’-GAA GTA ACC ACG GTC GTG-3’，5’-GCT CTC GAA CAG CCC CAT TA-3’目的扩增基因片段长度为495 bp，与伪狂犬、猪瘟、传染性胃肠炎、轮状病毒和圆环病毒等病原引物合成由生工生物工程( 上海) 有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 返饲材料制备 返饲材料为3日龄内发病，24 h内确诊PED的仔猪的整段肠道及内容物，经RT-PCR病原检测，伪狂犬、猪瘟、传染性胃肠炎、轮状病毒和圆环病毒等病原检测为阴性。称重按每100 g加入100 mL含青链霉素各60万单位的生理盐水，用组织捣碎机匀浆，48 h内冷藏使用。

1.2.2 血清制备 将上述制备好的抗原组织按每头猪50 mL量返饲健康猪只，次日以超30%的猪只出现呕吐、腹泻、厌食为标准，进行第二轮返饲，二次返饲后出现临床症状猪只比例超过90%，证明返饲成功。二次返饲后每隔3 d清晨空腹经前腔静脉无菌采血，自然凝固分离血清，进行PEDV IgG抗体检测大量采集达到峰值血清作为备用高免血清，56 ℃灭活1.5 h，自然冷却后，加入青链双抗，密封冷冻保存备用。

1.2.3 抗血清检验 无菌检查：将分离的血清分别接种于普通培养基与鲜血琼脂培养基，37℃培养18～24 h后观察是否有菌落生长。

安全性试验：将培养无细菌生长的血清对体重18～22 g的健康小白鼠5只进行皮下注射，每只0.5 mL，观察一周，每日量体温，观察是否发病。

特定病原检测：对备用筛选血清、返饲供体猪只的粪便和肛门拭子进行特定病原检测。

1.2.4 预防试验 随机选取发病猪场PED免疫母猪所产初生仔猪，试验组22头，对照组26头。试验组于仔猪出生后2 h内每头灌服高免血清5 mL，隔日再灌服1次。对照组不做处理。试验日至断奶日期间观察猪只有无出现呕吐，黄白色或黄绿色水样稀粪等PED临床症状，判断保护率。

1.2.5 治疗试验 选用发病猪场自然发病初生仔猪，经诊断为PED感染的4窝仔猪47头，根据分娩先后，按自然窝，随机分成2个组，即血清治疗组与常规药物治疗对照组，血清治疗组2窝23头，视患猪的日龄，体重大小，每头每次灌服自制血清3～4 mL。如24 h内未痊愈的，可再注射同样剂量1次。药物治疗组(黄芪多糖，杨树花 )2窝24头，按患病仔猪的体重大小，采取不同剂量分别口服黄芪多糖和杨树花，每天2次，连续2 d。试验期间密切观察仔猪临床变化，3 d内精神恢复正常，腹泻停止，精神、食欲、粪便状态恢复正常，判断为治愈。否则，判为无效。

2 结果

2.1 PEDV抗体检测

用ELISA方法检测返饲后血清中PEDV IgG抗体水平，计算平均值。如图1所示，IgG抗体水平峰值出现在返饲后第19天，均值可达到1.836，高水平表达至第25天左右。

2.2 高免血清的无菌检査、安全性试验和PEDV检测

将灭活测定高效价血清分别接种于普通培养基、鲜血琼脂培养基，置于培养箱培养, 未发现任何细菌生长；皮下注射昆白鼠未发现异常反应。流行性腹泻、伪狂犬、猪瘟、传染性胃肠炎、轮状病毒和圆环病毒等病原检测为阴性。

2.3 高免血清预防试验

预防试验仔猪在20日龄内未出现大规模呕吐，频频拉白色、黄白色或黄绿色水样稀粪等症状。由表1数据可知，高免血清+疫苗组和疫苗组的发病率为9.09%和38.46%，截止断奶期高免血清+疫苗组和疫苗组的淘汰率分别为13.64%和26.92%，差异显著(P<0.05)。

表1 预防效果比较

2.4 高免血清治疗试验

由表2可知，治疗，高免血清组和药物对照组对PED的治愈率分别为82.6%和16.67%，未治愈死亡率分别为17.4%和83.3%。高免血清组与药物对照组之间有极显著差异 (P<0.01)。

表2 治疗效果比较

3 小结与讨论

猪流行性腹泻是近年来困扰养猪业的一项重大肠道传染病，但由于毒株差异以及疫苗实际应用程序复杂而保护率差异很大。大多数情况下，PEDV的感染仍然是能引起仔猪大量死亡的棘手疾病。仅仅依靠商品疫苗免疫很难及时有效防控PED造成巨大损失。临床上常常返饲妊娠母猪利用人工自然免疫使得妊娠母猪在短期内集中感染，从而在分娩时获得高效的母源抗体[6]，利用母源抗体保护后代仔猪度过危险期。国内由于猪场病原比较复杂，因返饲后部分母猪持续排毒，反复爆发，导致返饲风险措施的安全性和有效应用不被认可[5～8]。笔者应用场内返饲方法制备高免血清，既能针对性的保证病原的较高抗原性又能保证的安全性。笔者研究通过给成年健康猪2只次大量的返饲后采取第19天IgG处于峰值期的高免血，清效价均值1.84，同时PED病原检测为阴性。进行临床预防治疗试验，结果显示本研究制备的高免血清可以提供的93.2%的保护率和87.5%的治愈率，防治效果非常显著，说明该方法自制高免血清能起到较好的预防与治疗效果，具有很高的临床价值，同时操作简单、安全有效。

初生仔猪腹泻原因复杂，因此血清治疗必须配合科学分析进行防治，并要根据实际情况加强母猪、仔猪饲养管理，做好保温、卫生等环境工作；合理防疫，及时让初生仔猪吃足初乳，增强仔猪抵抗力；必要时采用结合抗生素治疗，才能更好地发挥防治作用。