卜 兰 熊 亮 刘 菲张 潇蒙春旺*郭 力*

（1.成都中医药大学药学院，教育部中药材标准化重点实验室，四川 成都611137； 2.西南特色药材创新药物成分研究所，四川 成都611137）

KEY WORDS：Lonicera similisHemsl.；the buds；hexanor⁃triterpenoid；chemical constituents；isolation and identification

忍冬科忍冬属植物细毡毛忍冬Lonicera similisHemsl.在我国西南地区作为金银花使用，其性寒味甘，具有清热解毒、疏散风热的功效［1］。细毡毛忍冬与金银花在功效主治上有极高的相似性，且其有效成分绿原酸的含量远高于《中国药典》 金银花的收载品种忍冬［2］，在西南地区，细毡毛忍冬作金银花使用具有悠久的历史。近年来关于忍冬属植物化学成分及药理作用的研究较为丰富，主要集中于环烯醚萜苷、三萜皂苷等活性成分［3⁃5］及其抗炎解热、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理活性［6⁃9］。课题组前期从细毡毛忍冬乙醇提物中分离得到一系列新的皂苷类化合物，其中一个单糖皂苷显示显著的肿瘤细胞毒作用［10］。为进一步研究细毡毛忍冬的药效物质基础，本实验结合多种现代分离纯化技术及波谱技术，在细毡毛忍冬的乙醇冷浸液中分离得到一个罕见的六降三萜，鉴定为3β，20⁃二羟基⁃22，23，24，25，26，27⁃六降羊毛脂烷⁃8⁃烯⁃11⁃氧代⁃29⁃酸。

1 材料

中压液相色谱仪（Búchi Gradient Former B⁃687，Rp C18，40～60 μm，瑞士Welch 公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣仪器生化厂）；紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）；Milli⁃Q 超纯水仪（美国Milli⁃pore 公司）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Bruker⁃600 核磁共振波谱仪（德国Bruker 公司）；Waters Synapt G2 高分辨质谱仪（美国Waters 公司）。

柱色谱硅胶（200～300 目，H 硅胶、GF254薄层色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；D101 大孔吸附树脂（安徽三星树脂科技有限公司）；葡聚糖凝胶Sephadex LH⁃20（瑞典Amershan Pharmacia 公司）；色谱甲醇（美国Sigma 公司）；所用常规试剂均为分析纯，购自成都科龙化学品有限公司。

细毡毛忍冬由四川南江县百草药业有限公司提供，经成都中医药大学药学院龙飞老师鉴定为忍冬科植物细毡毛忍冬Lonicera similisHemsl.的干燥花蕾，标本（XZMRD⁃1）存放于成都中医药大学西南特色药材创新药物成分研究所。

2 提取与分离

细毡毛忍冬干燥花蕾9.5 kg 用70%乙醇冷浸法提取3 次，1 次24 h，将提取液合并，减压浓缩得到总浸膏。将乙醇总浸膏用蒸馏水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将正丁醇萃取液浓缩成浸膏，得到细毡毛忍冬正丁醇萃取部位（650 g）。将正丁醇萃取物（650 g）经D101 大孔吸附树脂富集，用10%、30%、50%、70%、95%乙醇进行梯度洗脱，回收溶剂得到5个洗脱部分（A～E）。采用硅胶柱对E 部分（8.35 g）进行色谱分离，经二氯甲烷⁃丙酮（50∶1～1∶1）梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合并组成相似的馏分，回收溶剂得到5个洗脱部分（E1～E5）。取E1部分经Sephadex LH⁃20 凝胶柱氯仿⁃甲醇（1∶1）分离得到6个洗脱部位（E1⁃1～E1⁃6），取E1⁃2 部分经制备薄层色谱氯仿⁃甲醇⁃水⁃冰乙酸（7∶3∶0.5∶0.1）及半制备HPLC 色谱甲醇⁃水（55∶45）分离纯化得化合物1（9 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末。HR⁃ESI⁃MSm／z：405.264 9［M＋H］＋（计算值C24H37O5，405.264 1）分子式C24H36O5，不饱和度为7。其1H⁃NMR 显示有5个甲基质子信号，分别为δH0.82（s，H3⁃18）、δH1.17（d，H3⁃21）、δH1.18（s，H3⁃19）、δH1.19（s，H3⁃30）、δH1.36（s，H3⁃28）；有4个次甲基信号，其中2个氧代次甲基［δH3.61（m，H⁃20）、δH3.05（dd，H⁃3）］；剩下的质子信号归属为7个亚甲基。此外，化合物1的13C⁃NMR 数据表明共24个碳原子，1个特征的α，β 不饱和酮片段［δC201.3（C⁃11）、δC167.6（C⁃8）、δC140.0（C⁃9）］，有2个连氧叔碳δC71.2（C⁃20）和δC79.6（C⁃3），1个羧羰基δC186.2（C⁃29），5个甲基碳δC17.5（C⁃18）、δC18.0（C⁃19）、δC23.8（C⁃21）、δC25.6（C⁃28）和δC26.1（C⁃30），7个亚甲基碳δC36.2（C⁃1）、δC30.4（C⁃2）、δC26.4（C⁃6）、δC31.9（C⁃7）、δC52.0（C⁃12）、δC32.0（C⁃15）和δC20.7（C⁃16），2个次甲基碳δC55.5（C⁃5）和δC53.7（C⁃17），以及4个季碳δC49.6（C⁃4）、δC39.5（C⁃10）、δC47.3（C⁃13）和δC53.1（C⁃14）。为进一步确定化合物结构，进行了2D⁃NMR 实验，根据HSQC 谱对1H 及13C 信号进行了准确归属，见表1。通过1H⁃1H COSY 归属出3个自旋耦合片段，分别是H⁃1／H⁃2／H⁃3；H⁃5／H⁃6／H⁃7；H⁃15／H⁃16／H⁃17／H⁃20／H⁃21，见图1。在HMBC 谱中，显示H3⁃28 与C⁃3、C⁃4、C⁃5 和C⁃29 相关，H⁃3 与C⁃2、C⁃4、C⁃28 和C⁃29 相关可推出28⁃CH3和29⁃COOH连在4 位上；H3⁃18 与C⁃12、C⁃13 和C⁃14 相关，H3⁃19 与C⁃1、C⁃5、C⁃9 和C⁃10 相关，H3⁃30 与C⁃8、C⁃13、C⁃14 和C⁃15 相关可推出18⁃CH3、19⁃CH3、30⁃CH3分别与C⁃13、C⁃10 和C⁃14 相连；此外，H3⁃21 与C⁃17 和C⁃20 有BC 相关，H⁃17 与C⁃12、C⁃13、C⁃16 和C⁃20 有BC 相关推出21⁃CH3与C⁃20 相连、C⁃20 与C⁃17 相连；根据上述信号表明化合物1为一个罕见的六降羊毛脂烷三萜。为确定化合物1的构型。通过NOESY 谱观察到H3⁃30 与H⁃12b 和H⁃17 有相关，H3⁃21 与H⁃17 有相关，H⁃5 与H⁃3、H⁃8a 和H⁃16b 有相关，H3⁃28 与H⁃3、H⁃5 和16b 有相关，表明H⁃3、H⁃5、H⁃17、21⁃CH3、28⁃CH3和30⁃CH3为α 构型；另外，H⁃20 与H3⁃18 和H3⁃19 有相关，H3⁃18 与H⁃12a、H⁃15b 有相关，同时H⁃15b 与H⁃8b 有相关，表明18⁃CH3、19⁃CH3为β 构型，因此化合物1的结构得到确定，命名为3β，20⁃二羟基⁃22，23，24，25，26，27⁃六降羊毛脂烷⁃8⁃烯⁃11⁃氧代⁃29⁃酸。

表1 化合物1 的1H⁃NMR（600 MHz， CD3OD） 及13 C⁃NMR（150 MHz， CD3OD） 数据Tab.1 1H⁃NMR（600 MHz， CD3OD） and13 C⁃NMR（150 MHz， CD3OD） data of compound 1

图1 化合物1 的结构和主要HMBC 及1H⁃1H COSY 相关Fig.1 Structure， key HMBC and1H⁃1H COSY correlations of compound 1

4 讨论

三萜类是细毡毛忍冬发挥传统功效的物质基础之一［11］，其中羊毛脂烷型三萜具有良好的研究价值，如从南五味子［12］、担子菌地皮［13］、弗氏灵芝［14］中发现的羊毛脂烷型三萜分别具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒的作用。细毡毛忍冬的抗肿瘤作用与其传统功效“清热解毒”有着紧密的联系，因此研究细毡毛忍冬的羊毛脂烷三萜可为后期研究其抗肿瘤的活性奠定基础。

本实验对细毡毛忍冬70% 乙醇冷浸液进行化学成分研究，并分离得到1个罕见的六降羊毛脂烷三萜。目前报道的降碳羊毛脂烷三萜较多，但多为降一碳，以19 位降碳最常见，而降六碳的羊毛脂烷型三萜十分罕见，仅有Ganoderma cochlear中发现的ganolearic acid A［15］和在灰毡毛忍冬中分离得到的lonimacranthoidin E［16］，同时lonimacranthoidin E 对HeLa细胞具有明显的抗增殖作用，推测降六碳羊毛脂烷三萜是灰毡毛忍冬蕴含的一类特殊化学成分，该类成分及其活性值得进一步研究。