董春光，韩一超，杨丽华，刘文俊，韩文儒，陈剑波，武守艳

（山西农业大学山西省农业科学院畜牧兽医研究所，太原030032）

0 引 言

金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，该菌不仅能引起动物和人的化脓性炎症，还是一种食源性病原菌[1-2]。牛奶是公认的健康食品[3]，但我国年人均饮奶量及其质量亟待提高[4]，由于牛奶本身易受微生物污染而腐败的特性，其食品安全问题也逐渐凸显，如2012年韩国出口中国的金黄色葡萄球菌污染牛奶事件更引发公众对乳产品质量安全的担忧。因此，探索检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法具有重要的意义。牛奶腐败后可以产生异味，而目前尚未见运用HS-SPME/GC-MS检测金黄色葡萄球菌污染牛奶的挥发性代谢物的报道。本文应用HS-SPM E/GC-MS方法，通过条件优化，检测了鲜奶和被金黄色葡萄球菌污染的鲜奶中挥发性代谢物的差异，为检测牛奶中的葡萄球菌提供新的思路。

1 实 验

1.1 仪器及试剂

1.1.1 仪器

SPME手柄及75μm CAR/PDMS（碳分子筛/聚二甲基硅氧烷）萃取头，美国Supelco；Thermo Scientific ISQ单四极杆GC-MS系统，美国Thermo；色谱柱（30 m×0.25mm×0.25μm），美国Thermo；顶空瓶（20 mL），美国Thermo；麦氏比浊管。

1.1.2 试剂

市售巴氏杀菌乳，金黄色葡萄球菌由山西省农业科学院畜牧兽医研究所动物临床研究室保存，血琼脂平板培养基，7.5%的氯化钠肉汤，生理盐水。

1.2 方法

1.2.1 鲜奶的无菌检验

以无菌操作取鲜奶，接种至7.5%的氯化钠肉汤中，（36±1）℃培养24 h，然后将培养液接种至营养琼脂平板，（36±1）℃培养24 h观察结果。

1.2.2 菌液的制备

取-80℃保存的金黄色葡萄球菌菌种，接种于血琼脂平板培养基，37℃培养12～24 h，进入对数生长期后，利用0.5号麦氏比浊管制成1.5×108mL-1的金黄色葡萄球菌菌液，经梯度稀释后得到1.5×107mL-1的金黄色葡萄球菌菌液备用。

1.2.3 待检样品的制备

用无菌移液管移取9 mL鲜奶加入1 mL浓度为1.5×107mL-1金黄色葡萄球菌菌液，制备成1.5×106m L-1的金黄色葡萄球菌污染的牛奶样品，以同样的方法制备1.5×105mL-1的金黄色葡萄球菌污染的牛奶样品。

用无菌的移液管分别移取5 mL上述金黄色葡萄球菌污染的牛奶样品置于3支无菌顶空进样瓶中，同时用另1支无菌移液管分别移取5 mL无菌鲜牛奶置于3支无菌顶空进样瓶中作为空白对照。空白对照于4℃保存，菌液污染的牛奶均在37℃下培养24 h，然后一起进行HS-SPME/GC-MS测定。

1.2.4 分析条件

色谱条件：进样口温度270℃，分流比10∶1，载气为高纯氦气，流速1 mL/min，升温程序：40℃保持3 min，5℃/min升到150℃，10℃/min升到250℃，保持5 min，整个程序40 min。质谱条件：EI离子源，离子源温度：280℃，传输线温度：280℃，扫描质量范围：45～500 amu。

2 结 果

2.1 鲜奶无菌检验结果

鲜奶样品经两次接种培养后，在营养琼脂平板上无菌落生长，表明鲜奶中无金黄色葡萄球菌污染。

2.2 挥发性代谢产物分析

在上述检测条件下，综合各成分响应强度最高，空白鲜奶和金黄色葡萄球菌污染的鲜奶的挥发性物质的色谱如图1和图2所示。

图1 空白鲜奶挥发性物质色谱

图2 金黄色葡萄球菌污染的鲜奶挥发性物质色谱

由图1和图2可以看出，在空白鲜奶和金黄色葡萄球菌污染的鲜奶的图谱中，峰数量和峰面积均有较大差异，表明被金黄色葡萄球菌污染的鲜奶组的挥发性物质与空白鲜奶组相比，发生了较大变化。

应用NIST MSSearch 2.0质谱数据库的质谱数据进行计算机检索比对，并对检索结果进行解析，结果如表1所示。

由表1可以看出，空白鲜牛奶组鉴定出共同挥发性物质11个，其中醇类2个、酮类4个、醛类1个、烷烃类2个、烯烃类1个、酚类1个；葡萄球菌污染的牛奶组鉴定出共同挥发性物质11个，其中酸类5个、酮类3个、醇类1个、烷烃类1个、酚类1个；两组共同的挥发性物质有5个，分别是2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮、正十四烷、2,6-二叔丁基对甲酚；空白鲜牛奶组特有的挥发性物质有6个，分别为2-十六醇、2-戊酮、异辛醇、壬醛、3-甲基十三烷、角鲨烯；葡萄球菌污染的牛奶组特有的挥发性物质有6个，分别是L-2-氨基丁酸、丁酸、异戊酸、2-壬醇、正辛酸、正癸酸。

表1 空白鲜奶和金黄色葡萄球菌污染的鲜奶的挥发性物质

3 结果与讨论

本研究空白鲜牛奶组共鉴定出共同挥发性物质11个，葡萄球菌污染的牛奶组鉴定出共同挥发性物质11个。周超等应用HS-SPME/GC-MS分析了空白鲜牛奶和大肠杆菌污染的鲜牛奶的挥发性代谢产物，结果空白对照组中鉴定出挥发性物质17种[5]，本试验空白对照组的物质种类与前述研究中有差异，可能与使用的检测仪器及奶源不同等有关。另外，本试验中空白鲜奶组未检测到酸的成分，在葡萄球菌污染的牛奶组检测到了5种酸类物质，可能与鲜奶被病原微生物污染后容易发生酸败有关。

顶空技术（HS）通过将样品放入密闭的体系中加热，使其内部挥发性成分进入气相，根据气相和液相中成分的比值关系，间接得到其在样品中的含量[6-7]，该方法采用气体直接进样的方式，消除大部分样品对检测的干扰和色谱柱的污染，同时免去了一系列样品前处理程序，大大简化了样品处理步骤。顶空固相微萃取是固相微萃取的一种[8]，该技术特别适用于平衡态下易挥发性有机化合物的检测，且可以避免样品中其他成分对萃取效果的影响，具有很好的可重复性，近年来在食品香气成分分析、药物检测和环境监测等领域的应用越来越广泛[9-11]。牛奶作为人们的日常消费品，其营养物质丰富，易于被机体吸收，是一种优质的健康食品。但是在奶牛发生乳房炎或在挤奶、保存及运输过程中牛奶很容易被金黄色葡萄球菌污染[12-13]，而一旦有微生物的污染，牛奶的性状和气味极易发生变化。因此，HS-SPME/GC-MS技术鉴别新鲜牛奶和微生物污染的牛奶具有非常大的优越性，本试验研究可为快速鉴别金黄色葡萄球菌污染的鲜奶提供理论依据。