高馨悦，严理，刘头明

(中国农业科学院麻类研究所/农业农村部麻类生物学与加工重点实验室，湖南 长沙 410205)

植物营养生长向生殖生长转换的过程称作开花诱导，是高等植物生命周期中最重要的过程之一，这一过程受植物内部多种基因和外部环境(如光照、温度等)影响[1]。随着近年来分子生物学的高速发展，在拟南芥和水稻等模式植物中，分离并鉴定出大量的开花相关基因。前人研究[2-3]明确了控制植物开花至少有6条主要途径：光周期途径、春化途径、赤霉素途径、温敏途径、自主途径和年龄依赖途径。这些途径对不同环境和植物体内的各种因子产生反应并转换成相应的新信号，最后将新信号传递给开花整合因子，由其促进花分生组织特异基因的表达，诱导花的形成。FT(FLOWERING LOCUS T)是开花诱导过程中最重要的整合因子之一，在成花转变中起着至关重要的作用，所有调控途径几乎都汇集于FT[4]。

FT基因能促进植物开花的功能最早是在拟南芥中发现的。经前人研究，FT基因是在拟南芥叶片中被诱导表达，其蛋白质由叶片经过韧皮部移动到达茎顶端组织[5-7],在顶端分生组织中FT蛋白与FLOWERING LOCUS D (FD)和14-3-3蛋白互作并形成复合体，共同促进下游开花基因的表达，从而促进开花[8]。在水稻中，分离出的Hd3a基因编码的蛋白与拟南芥的FT基因编码的蛋白高度同源，同样是在叶片中表达、合成并转运到顶端分生组织，并于合适的光照条件下促进植株开花[6]。FT基因编码的小分子蛋白为175个氨基酸，属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyle-thanolamine-binding protein, PEBP)家族基因，哺乳动物中的PEBP蛋白能结合磷脂酰乙醇胺，植物中的PEBP磷脂酰乙醇胺结合蛋白是植物生物膜结构上的主要磷脂，发挥重要的蛋白质识别和信号传导作用[9]。

苎麻属于短日照双子叶植物，具有诱导成花的临界日长和敏感期[10]。延迟苎麻开花，有利于延长其营养体生长时间，提高作物的纤维产量。而大蒜属于长日照单子叶植物。苎麻基因组未发生近期的全基因组复制事件，因此其基因组较小(约270 Mb)(数据源于NCBI PRJNA663427)，而大蒜基因组近期发生了两次全基因组复制事件，导致其基因组达到16.9 Gb[11]。由于大蒜在进化过程中发生了数次全基因组复制事件，使得大蒜基因家族扩张并出现基因冗余现象，致使大蒜FT基因家族中的基因数量增多。在前人对植物FT基因的研究中，多是用单子叶的水稻和双子叶的拟南芥进行比较，少有研究将其他单、双子叶植物的FT基因进行比较，因此，单、双子叶FT之间的差异和联系还存在一定空白。本研究中单子叶大蒜和双子叶苎麻，该两种植物中的FT家族基因在日前的研究中还鲜有报道，并且两种植物中的FT进化机制当前仍不清楚。因此，本研究以双子叶植物苎麻和单子叶植物大蒜为对象，基于大蒜与苎麻中FT蛋白的同源性比较进一步分析，旨在为今后单、双子叶的成花研究奠定一定基础，为改良苎麻和大蒜这两种经济作物的开花时间提供基因资源。

1 材料与方法

1.1 苎麻和大蒜的基因筛选

以“flowering locus T”为关键词，对苎麻和大蒜的基因组注释数据分别进行搜索。为保证搜索到的基因为苎麻和大蒜FT基因，将得到的基因所编码的蛋白序列在NCBI的Conserved Domains(http:// www. Ncbi. nlm. nih. gov/ Structure/ cdd/ wrpsb. cgi)上完成保守结构域预测，并将这些FT蛋白序列在NCBI中与其他物种FT蛋白进行比对，筛选出具有PEBP保守结构域的苎麻和大蒜FT基因。

1.2 序列比对

收集拟南芥成花基因FT(AtFT)[12]和水稻中Hd3a[13]基因(见表1)。结合AtFT蛋白与Hd3a蛋白的保守结构域及本研究中筛选到的苎麻和大蒜中FT基因所编码的蛋白保守结构域，利用DNAMAN软件进行蛋白多序列比对。最后采用MEGA 7.0软件对AtFT/Hd3a蛋白和苎麻、大蒜中FT基因所编码的全长氨基酸序列进行进化树分析，分析模型采用Neighbor-Joining法，每个点计算1000次。

表1 苎麻和大蒜FT家族基因列表

2 结果与分析

2.1 苎麻和大蒜FT家族基因筛选

根据NCBI中公布的青叶苎麻[14]基因组(序列号：PRJNA663427)的注释基因，以“flowering locus T”为关键词对基因组注释进行搜索，得到2个注释为“flowering locus T”的苎麻基因，这两个基因编码蛋白具有完整的PEBP结构域序列，推测是全长cDNA。根据Sun等[11]完成的“二水早”大蒜基因组测序数据，以“flowering locus T”为关键词对基因组基因注释进行搜索，得到25个注释为“flowering locus T”的大蒜基因，其中14个大蒜基因不具有完整的PEBP结构域，故予以剔除。最后筛选到2个苎麻FT基因和11个大蒜FT基因，这些结果说明大蒜FT基因家族发生了显著扩张。

2.2 FT蛋白序列比对

在拟南芥中，AtFT蛋白的功能主要是由其自身蛋白结构特点决定的，其中大多数残基的突变对其蛋白的开花调控功能影响不显著。但是，其中5个残基(Tyr-85、Glu-109、Trp-138、Gln-140 和 Asn-152) 中的任意一个发生突变都可能导致其功能的完全改变[15-16]。为了研究苎麻和大蒜FT基因间的序列类似性，将已知模式植物拟南芥FT基因以及水稻Hd3a基因的编码蛋白序列与本研究鉴定的2个苎麻FT基因和11个大蒜FT基因进行多蛋白保守结构域序列比对。从图1可以看出，拟南芥FT和水稻Hd3a蛋白与双子叶植物苎麻Bnt01G000036基因和Bnt02G002054基因编码的氨基酸序列在Tyr-85、Glu- 109、Trp-138、Gln-140和Asn-152这5个关键氨基酸残基处非常保守，而大蒜11个FT所编码的蛋白中，只有4个FT蛋白(Asa2G02821.1、Asa6G00732.1、Asa7G06383.1和Asa7G06386.1)在这5处氨基酸残基位点非常保守。Asa0G05138.1、Asa8G04470.1、Asa6G06199.1和Asa6G06200.1 4个蛋白都有一个关键氨基酸发生变化，其中Asa0G05138.1和Asa8G04470.1是在152位的Ser发生变异，而Asa6G06199.1和Asa6G06200.1则在138位Val发生变异；Asa6G00188.1有两个关键氨基酸发生变异，分别为138位的Val和152位的Ser；Asa8G01025.1以及Asa8G01036.1与苎麻FT蛋白、AtFT和Hd3a等蛋白差异最大，只在第85位的关键氨基酸一致，其余4个关键氨基酸皆不同，分别变异为Val(第109位)、Val(第138位)、His(第140位)、Try(第152位)。

图1 FT保守结构域序列比对Fig.1 FT conserved domain sequence alignment

2.3 FT家族基因系统进化分析

为进一步分析苎麻和大蒜FT基因与AtFT/Hd3a基因之间的同源性，对这 15个FT同源蛋白进行系统进化树分析，结果如图2所示。15个FT蛋白被分为3类，其中苎麻蛋白Bnt01G000036、Bnt02G002054，大蒜蛋白Asa2G02821.1、Asa6G00732.1、Asa8G04470.1、Asa0G05138.1与AtFT/Hd3a蛋白同属一类蛋白亚家族；大蒜蛋白Asa6G06199.1、Asa6G06200.1、Asa7G06383.1、Asa7G06386.1属于第二类FT蛋白亚家族；而大蒜蛋白Asa6G00188.1、Asa8G01025.1和Asa8G01036.1则属于第三类FT蛋白亚家族。由图2可知，只有4个大蒜FT基因与苎麻FT基因归于一类，其余7个大蒜基因又分成两类。此外，深入分析第一个FT蛋白亚家族发现，苎麻FT同源蛋白Bnt01G000036、Bnt02G002054与拟南芥AtFT和水稻的Hd3a具有非常近的同源关系，而大蒜的4个FT同源蛋白进化关系相对较远。其中，Bnt01G000036与AtFT、Hd3a的蛋白序列一致性分别为67.98%和69.44%，而Bnt02G002054与AtFT、Hd3a的蛋白序列一致性分别为76.70%和77.78%。这些研究结果说明苎麻FT同源蛋白在进化过程中非常保守，而大蒜FT同源蛋白在扩张后发生了大量变异。

图2 FT蛋白序列进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of FT protein sequence

3 结论与讨论

苎麻纤维是我国特色天然纤维，其从茎皮中剥取，属于营养体纤维。苎麻茎叶中富含粗蛋白，也被广泛用作饲草。较长的营养体生长周期有利于提高苎麻的纤维和嫩茎叶产量。苎麻对光周期敏感，短日照条件下苎麻易开花，从而降低营养体产量。因此，培养光周期钝感的苎麻品种，延迟苎麻开花时间，是苎麻高产育种的重要目标，同时有助于实现苎麻产业向低纬度的东南亚地区转移。FT基因是植物成花过程中重要的因子之一，FT功能和蛋白结构在许多植物中高度保守。小麦[17]、大麦[18]、棉花[19]、豌豆[20]、黑麦草[21]等诸多植物中的FT蛋白在Tyr-85、Glu-109、Trp-138、Gln-140和Asn-152这5个关键氨基酸残基位点皆与AtFT/Hd3a蛋白相一致，这些植物FT蛋白都与植物开花调控相关。本研究在苎麻中鉴定到两个FT家族成员，其序列上都与AtFT/Hd3a高度同源。由此也可说明，苎麻中的FT基因家族在进化上是非常保守的，这为研究苎麻的开花进化机制奠定了基础，而苎麻中成花素FT蛋白的鉴定也为开展苎麻的光钝感品种选育提供了基因资源。

本研究发现，随着大蒜基因组的扩张，大蒜FT家族基因数量也随之发生了急剧扩张，家族成员达到了11个，家族成员过多可能会出现功能冗余。一般地，如果基因家族成员间功能冗余，当某一成员发生突变，其功能可能会由其他成员予以补偿，而导致个体性状并未发生改变，进而将这种基因模式遗传给后代，以维持物种在自然界中的稳定。因此，推测这是大蒜FT家族成员广泛扩张的一个可能原因。但由于成员之间蛋白序列发生了广泛变异，也可能会导致部分基因功能分化。在前人的研究中发现，FT除了调控植物的开花，还能够参与植物的其他发育过程，如块茎形成、气孔闭合和低温响应等[22]。在洋葱和马铃薯的研究中发现，FT蛋白对于调控块茎/鳞茎膨大具有非常关键的作用[23-24]。LEE等[24]发现洋葱中有AcFT1-AcFT6共6类FT基因，AcFT1基因可以促进鳞茎形成，AcFT4基因抑制鳞茎的形成，AcFT2基因的表达与开花相关，而AcFT3、AcFT5和AcFT6基因作用还未被确定。大蒜与洋葱同属百合科葱属植物且FT家族基因在蛋白序列上都存在广泛变异。因此，以洋葱FT基因家族为参照，为今后研究FT家族基因在大蒜生长发育中的功能(尤其在开花调控、鳞茎形成中的功能)提供了一定的帮助。

在以往对短日照单子叶植物水稻和长日照双子叶植物拟南芥的开花调控研究中发现，两者开花调控存在较大的相似性，同时又具有一定的差异[25]。本研究进一步分析了长日照单子叶植物大蒜和短日照双子叶植物苎麻的成花素FT蛋白进化，研究结果进一步丰富了对植物开花进化机制的认识。