刘 晓 陆智斌 刘 磊,* 叶央芳 母昌考 刘长军 王春琳

(1 宁波大学海洋学院, 浙江 宁波 315211；2 浙江象山县水产技术推广站， 浙江 宁波 315700)

拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)隶属于甲壳纲(Crustacea)十足目(Decapoda)梭子蟹科(Portunidae)青蟹属(Scylla)，是分布在东南亚各国和其他印度洋、太平洋沿岸国家的一种重要经济蟹类[1-2]。2018年我国拟穴青蟹养殖产量约为15.7万t[3]。然而，由于拟穴青蟹外壳坚硬，攻击性强，给消费者食用带来诸多不便[4]。软壳蟹即刚完成蜕壳后尚未硬化阶段的蟹。与普通硬壳蟹相比，软壳蟹无攻击性，洁净无污染，可整体食用，市场前景极其广阔[5]。软壳蟹生产已成为青蟹产业提升的一个重要方向。

目前，除拟穴青蟹外，美洲蓝蟹 (Callinectessapidus)、锯缘青蟹(Scyllaserrata)、雪蟹(Chinoecetesopilio)、红星梭子蟹(Portunussanguinolentus)和三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)等均可以生产成软壳蟹。根据现已报道的软壳蟹营养物质分析发现，不同蟹类在蜕壳后营养物质组成呈现差异变化，如三疣梭子蟹在蜕壳后，蛋白质和脂类含量比硬壳蟹低，但氨基酸和脂肪酸水平却与硬壳蟹相当，值得关注的是三疣梭子蟹软壳蟹的钙含量显著高于硬壳蟹[6-7]。同样，中华绒螯蟹在蜕壳后，粗脂肪含量明显降低，而氨基酸含量却无显著变化[8]。与上述两种蟹不同的是，红星梭子蟹软壳蟹的蛋白质、碳水化合物、脂类、矿物质和氨基酸含量均低于硬壳蟹[9]，雪蟹[10]和美洲蓝蟹[11]的软壳蟹肌肉蛋白质含量也低于硬壳蟹。上述研究表明，蟹在蜕壳前后营养物质组成会发生改变，但是不同品种的蟹变化规律各有特点。目前已有针对硬壳和软壳拟穴青蟹营养研究的氨基酸比较[12]和代谢组学分析[13]等，研究发现拟穴青蟹软壳蟹可食组织(肌肉和肝胰腺)的小分子营养物质含量会随着蜕壳时间的延长而逐渐减少，但未能详细掌握对营养和风味具有重要贡献的其他营养物质，如矿物质元素、脂肪酸、挥发性物质等在蜕壳前后的差异。具体哪个时间点的软壳蟹营养成分和风味最佳，尚鲜有研究，且拟穴青蟹蜕壳前后营养品质变化特点也鲜有报道。

本研究拟通过对拟穴青蟹蜕壳后不同时间点软壳蟹和硬壳蟹肌肉和肝胰腺中水分、灰分、5种矿物质元素、17种氨基酸含量、脂肪酸和挥发性香气成分进行测定和比较，分析软壳蟹壳硬化过程中可食组织的水分、灰分、氨基酸、矿物质元素、脂肪酸和挥发性物质变化规律，明确在最佳收集时间段内不同时间点软壳蟹和硬壳蟹营养和风味物质的差异，以期为软壳蟹生产、营养和风味评价、市场价值评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

通过室内蟹公寓养殖生产制备试验用软壳蟹(图1-A、B)，选用硬壳蟹体质量为160.00±31.11 g。生产用水需进行沉淀、过滤、消毒、增氧等处理，软壳蟹生产水温25～27℃，生产盐度25%，生产期间控制环境条件基本一致。分别在拟穴青蟹蜕壳前48 h(TQ，背部甲壳与腹部甲壳之间出现明显裂痕，图1-C)、蜕壳0 h(图1-D、E)、蜕壳后6、12、24和48 h取样，每个时间点随机取3只，每只个体均取肌肉和肝胰腺。样品取得后充氮气密封，立即放入-80℃冰箱储存，用于相关指标的测定。

图1 拟穴青蟹软壳蟹生产设备和取样照片

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司；101-2AB电热鼓风干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司；MTN-5800氮吹仪，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；Trace1310 ISQ气相色谱质谱联用仪、ICP-MS电感藕合等离子质谱，美国Thermo Fisher Scientific公司；HH-4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；ICP-OES optima 8000电感耦合等离子光谱仪，美国Perkin Elmer公司；WX-8000微波消解仪，上海屹尧仪器科技发展有限公司；Dura series超纯水处理系统，上海和泰仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 水分和灰分含量测定 采用常压干燥法测定水分[14]，高温灼烧法测定灰分[15]。

1.3.2 氨基酸含量测定 氨基酸含量的测定参照GB/T 5009.124 -2016[16]，取适当质量的样品于水解管中，加入20 mL 6 mol·L-1的HCl溶液，采用高效液相色谱仪测定。

1.3.3 脂肪酸含量测定 参考刘磊等[17]的方法，称取适量均匀试样，以十九烷酸甲酯为内标，采用气相色谱-质谱连用仪测定脂肪酸含量。

1.3.4 顶空固相微萃取及气相色谱-质谱联用技术(headspace solidphase microextraction-gas-chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)检测 参考王珏等[18]的方法并稍作修改，称取3.00 g样品置于顶空瓶中，迅速密封。于80℃水浴平衡30 min，80℃萃取30 min。进样口解吸5 min。

GC条件：色谱柱 HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气，不分流，流速1.0 mL·min-1，进样口温度250℃，升温程序：初始温度35℃，保持2 min，以5℃·min-1升至230℃，保持5 min。

MS参数：离子源温度230℃，离子源EI，四级杆温度180℃。

采集到的质谱图利用计算机谱库进行检索，鉴定样品中的挥发性成分，利用峰面积归一化法分析各成分的相对含量[19-20]。

1.3.5 矿物质元素含量测定 参照GB 5009.268 -2016[21]中电感耦合等离子质谱法测定Ca、Mg、Fe、Se和Zn矿物质元素含量。

1.4 数据分析

采用Excel 2010软件进行数据统计，Origin 2018软件作图，SPSS 22.0软件对拟穴青蟹蜕壳前后不同时间点水分、灰分、氨基酸、脂肪酸、矿物质元素和挥发性物质进行标准差计算、单因素方差分析(one-way ANOVA)和差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 拟穴青蟹蜕壳前后不同时间点水分和灰分变化分析

由图2可知，拟穴青蟹软壳蟹肌肉和肝胰腺各时间点水分含量显著高于硬壳蟹(P<0.05)；软壳蟹肌肉中各时间点水分含量无显著差异；蜕壳后6 h与蜕壳后0、48 h软壳蟹肝胰腺水分含量差异显著(P<0.05)，蜕壳后其他时间点软壳蟹水分含量变化较小。

注：TQ:脱壳前。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

由图3可知，在软壳蟹各时间点中，肝胰腺的灰分含量是肌肉的2倍多，硬壳蟹的灰分含量显著高于软壳蟹(P<0.05)，蜕壳后0～6 h，肌肉灰分含量缓慢上升；肝胰腺作为拟穴青蟹的主要代谢和储藏器官，在拟穴青蟹蜕壳的代谢过程中发挥着重要的作用，蜕壳后12 h软壳蟹肝胰腺组织中的灰分含量急剧增加，可能是因为随着蜕壳时间的延长，壳硬化过程需要肝胰腺组织物质积累和代谢，然而12 h后，随着蜕壳时间延长肝胰腺中灰分含量又下降。

图3 拟穴青蟹蜕壳前后灰分含量变化

2.2 拟穴青蟹蜕壳前后不同时间点肌肉和肝胰腺组织中氨基酸组成成分分析

由表1可知，所测17种氨基酸在蜕壳前后拟穴青蟹肌肉组织中均检出，除丙氨酸，硬壳蟹的16种氨基酸含量均高于软壳蟹；在硬壳蟹肌肉17种氨基酸中，谷氨酸含量最高，其次是天冬氨酸，蛋氨酸含量最低。

表1 拟穴青蟹蜕壳前后肌肉中氨基酸含量

肝胰腺作为甲壳类消化吸收和营养供应核心，是青蟹参与代谢的主要器官[22]。由表2可知，硬壳蟹肝胰腺谷氨酸含量最高，其次是天冬氨酸，蛋氨酸含量最低。除肝胰腺中胱氨酸和丙氨酸外，硬壳蟹其他氨基酸含量均高于软壳蟹。蜕壳后6 h软壳蟹肝胰腺组织中有14种氨基酸均比其他时间点含量高。其中，丙氨酸是呈甜味氨基酸，因此，丙氨酸可能是硬壳蟹和软壳蟹肝胰腺甜味差异的主要贡献者之一[17]。

表2 拟穴青蟹蜕壳前后肝胰腺中氨基酸含量

2.3 拟穴青蟹蜕壳前后不同时间点矿物质元素在肌肉和肝胰腺组织中成分分析

由表3、4可知，拟穴青蟹肌肉和肝胰腺组织中5种矿物质元素均有检出，Mg和Fe元素含量在蜕壳0 h最高，在蜕壳后0～6 h均呈下降趋势；各矿物质元素在肌肉和肝胰腺中含量和变化趋势不同，肌肉组织中Mg含量高于其他矿物质元素，尤其是蜕壳0 h含量最高(462.33 mg·kg-1)； 在肝胰腺组织中，Ca含量最高，蜕壳0 h含量(11 550.00 mg·kg-1)显著高于蜕壳后其他时间点(P<0.05)。表明与硬壳蟹相比，蜕壳0 h软壳蟹肌肉和肝胰腺Ca、Mg含量丰富，且全身可食，适合小孩和老年人食用[6]。

表3 拟穴青蟹蜕壳前后肌肉中矿物质元素含量

2.4 拟穴青蟹蜕壳前后过程中脂肪酸组成成分与含量变化

由表5可知，拟穴青蟹肌肉组织共检出30种脂肪酸，从总量来看，C22:6n3在蜕壳前后高达7 476.08 mg·kg-1，约占肌肉总脂肪酸37%，其次是C20:5n3和C22:1n9，高含量的C22:6n3和C22:1n9在软壳蟹各时间点无显著性差异(P>0.05)，C20：5n3在蜕壳后24 h显著高于蜕壳0 h(P<0.05)。总的来看，SFA、MUFA和EPA+DHA总量在蜕壳前后并无显著差异，∑PUFA蜕壳0 h时降低，在蜕壳后24 h含量最高，且在脂肪酸风味上优于蜕壳后其他时间点。

如表6所示，蜕壳前后肝胰腺共检出32种脂肪酸，碳链长度在12～24C之间，含有主要必需脂肪酸C18：2n6[亚油酸(linoleic acid，LA)]、C18：3n3[亚麻酸(linolenic acid,LNA)]、C20：4n6[花生四烯酸(arachidonic acid,ARA)]、C20：5n3[二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)]、C22：6n3[二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)]，不同样品间脂肪酸种类有一定的差异；本研究测得的脂肪酸含量与已有的拟穴青蟹脂肪酸含量测定研究相比[22]较高，其中C22：6n3在蜕壳前后的肝胰腺中总量高达268 396 mg·kg-1，约占所有测出脂肪酸含量的53%，其次是C16：0和C20：5n3；从脂肪酸的组成特点来看，在拟穴青蟹蜕壳前后的过程中SFA含量最高的是C16：0，MUFA中C18：1n9C含量最高，PUFA中C22：6n3含量最高。HUFA在蜕壳0 h较蜕壳前上升，表明HUFA在蜕壳过程中可能主要作为能源物质提供所需能量，而在蜕壳后减少，表明HUFA可能转移出肝胰腺，且在新膜构建中被消耗，而在蜕壳后12～48 h含量逐次增加，表明其补充可能来自摄食[23]。上述结果表明，SFA和MUFA可能作为辅助能源物质参与蜕壳和壳硬化过程。

表6 拟穴青蟹蜕壳前后肝胰腺中脂肪酸含量

2.5 拟穴青蟹蜕壳前后不同时间点肌肉和肝胰腺组织中挥发性物质和风味分析

肌肉和肝胰腺组织中分别检出248和190种挥发性风味化合物，明显高于中华绒螯蟹[24]和虾类[25]的检测结果(P<0.05)。拟穴青蟹硬壳蟹与软壳蟹主要挥发性物质见表7、8。本研究检测的挥发性化合物主要为烷烃类化合物，该类化合物气味阈值较高，对气味形成贡献较小，其中1,2,4-三乙基环己烷、7,11-二甲基-3-亚甲基-1,6,10-十二碳三烯、2,3,4-三甲基正己烷在蜕壳前到刚蜕壳时的肌肉中相对含量较高。在肝胰腺组织中，3,5,5-三甲基-1-己烯，4-甲基-1,3-戊二烯、2-Methylenebicyclo[2，2，1]-heptane在刚蜕壳时可能对软壳蟹风味贡献较大。醛类化合物一般具有刺激性气味，如小分子的甲醛、乙醛等，但有些醛类并未检测到具体的气味，但它们是某些杂环风味化合物的前体，如苯甲醛被认为是肉香味重要的挥发性成分，且具有杏仁香、坚果香[26-27]，且在蜕壳后12 h含量比硬壳蟹含量高。醇类自身的阈值对食品风味的贡献很小，在刚蜕壳和蜕壳后6 h的肝胰腺中正辛醇、3-正癸醇含量较高，可能对软壳蟹风味贡献较大。酮类化合物一般具有清香和果香味，3-壬酮、2-甲基-3-辛酮分别在蜕壳后6和0 h的软壳蟹肝胰腺中检测到。在肝胰腺和肌肉组织中检测到的酯类化合物大多具有花香、果香、酒香或蜜香香气，对风味贡献不大。在酚类化合物中，苯酚具有某种药味，可能对风味有负面影响[26]。另外，一些芳香族化合物对硬壳蟹和软壳蟹风味影响程度需进一步探究。

表7 拟穴青蟹蜕壳前后肝胰腺组织挥发性香气化合物及相对含量

3 讨论

本研究通过分析拟穴青蟹蜕壳前后水分和灰分变化发现，软壳蟹的水分含量显著高于硬壳蟹，这与 Mizuta等[8]的结果一致；软壳蟹肝胰腺组织的灰分含量显著低于硬壳蟹(P<0.05)。蜕壳后6 h的软壳蟹肝胰腺组织中有14种氨基酸比其他时间点含量高，其中存在差异的呈味氨基酸有甘氨酸、精氨酸和亮氨酸，这与Jiang等[28]的研究结果一致。其中甘氨酸和精氨酸对蟹的甜味有重要贡献[29]，在蜕壳后6 h的肝胰腺组织中含量最高，但与蜕壳后其他时间点差异不显著。蜕壳后6 h软壳蟹肌肉组织中的丙氨酸含量明显高于其他蜕壳前后时间段，是风味上较其他时间段更加鲜甜的原因，丙氨酸可作为拟穴青蟹软壳蟹肝胰腺甜味的特征氨基酸。与正常青蟹的氨基酸含量相比[7]，本研究所测可食组织氨基酸含量整体偏低，可能是因为拟穴青蟹在蜕壳前不进食、蜕壳过程中需要大量物质代谢和能量消耗。

Ca、Mg、Fe、Zn和Se是人体所需矿物质[30]，而蟹类可提供人体所需的各种矿物质元素，尤其是可食组织Ca含量相较其他动物产品异常丰富[6,31]。拟穴青蟹蜕壳后肝胰腺和肌肉中5种矿物质元素含量在蜕壳0 h至蜕壳后6 h降低，与黄朝辉等[31]研究三疣梭子蟹软壳蟹矿物质的结果一致[31]。甲壳类个体的生长伴随着蜕壳，而蜕壳会导致Ca大量流失，新外壳钙化过程中需要更新补充Ca，本研究所测肝胰腺Ca含量在硬壳和蜕壳后各时间点变化为上述现象提供了数据支持。另外，Se是生物体所必需的微量元素, 已有研究表明，Se对水产动物的生长性能、抗氧化能力和免疫功能等都具有重要的作用[32]。本研究结果显示蜕壳前到蜕壳后6 h 2种组织中Se含量降低，之后逐渐上升，可能与蜕壳后拟穴青蟹壳硬化过程中抗氧化和免疫力的变化有关，但需进一步研究证实。

已有研究表明，蟹类肝胰腺中储存的脂类是拟穴青蟹蜕壳过程中主要能量来源物质之一，因此在蜕壳前期会储存有关的脂质以备后续新的外骨骼形成及停食期间新陈代谢所需[33]。本研究结果表明，蜕壳后0～12 h软壳蟹脂肪酸总量呈下降趋势，可能是由于青蟹蜕壳时需要消耗更多的能量重新构建内表皮及其他生理活动，蜕壳后24～48 h呈上升趋势，这一时间阶段壳硬化基本完成，随着摄食正常进行，脂肪酸含量升高，已经开始积累肝胰腺脂类物质为下一次蜕皮做准备。C20:4n6、C20:5n3和C22:6n3是磷脂的重要组成部分，是海产动物体内的重要脂肪酸，关系到幼体的蜕皮、生长和成活，是虾蟹类生长发育过程中的必需脂肪酸[34-36]。另有研究表明，摄入充足的n-3和n-6脂肪酸对儿童青少年的身体发育具有重要作用[37]。本研究发现上述3种物质在蜕壳0 h软壳蟹中含量最高，说明该时间点的软壳蟹营养价值高。

在挥发性物质中，烷烃类的来源较复杂，可能来自于脂质热降解产物或烷基自由基的脂质氧化和类胡萝卜素的分解[38]，某些支链烷烃仍具有一定的风味, 如2, 4, 10, 14-四甲基-十五烷、2, 6, 10, 14-四甲基-十五烷等具有一种清香味[39]，戊醛、己醛、庚醛、壬醛和葵醛被认为是淡水鱼肉中土腥味的主要成分。在本研究中蜕壳后6～12 h检出的上述醛类物质含量较低。在中华绒螯蟹[26]的蟹肉中，共有3种酮类被检测出来，分别为 3-壬酮、2-甲基-3-辛酮和6-甲基-5-庚烯-2 酮，其中3-壬酮和6-甲基-5-庚烯-2酮也曾在熟的小龙虾中被检测到[27]，在拟穴青蟹蜕壳前后不同时间点中，酮类物质只有0～6 h软壳蟹中检测到，说明蜕壳后0～6 h软壳蟹风味上优于硬壳蟹和其他时间点的软壳蟹。然而，如何保证拟穴青蟹在蜕壳后及市场流通过程中保持风味最佳状态，还要根据实际软壳蟹储运方式进一步研究。

4 结论

本研究对拟穴青蟹在蜕壳前后不同时间点的水分、灰分、氨基酸、不饱和脂肪酸、矿物质元素、部分挥发性化合物含量进行了测定与分析。结果表明，拟穴青蟹硬壳蟹和不同时间点软壳蟹营养物质和风味具有一定差异。软壳蟹各时间点水分含量高于硬壳蟹(P<0.05)；所测氨基酸含量在蜕壳前后总体差异不显著，但在蜕壳后6 h氨基酸含量总体高于蜕壳后其他时间点；在矿物质元素中，肝胰腺组织中Ca含量在蜕壳0 h显著高于其他蜕壳后时间点(P<0.05)。蜕壳0 h风味物质总数多于蜕壳前后其他时间点；拟穴青蟹蜕壳0 h脂肪酸含量最高，部分对风味有贡献的挥发性物质仅在0～6 h软壳蟹中检测到。综上表明，0～6 h软壳蟹在营养和风味上总体优于蜕壳后其他时间点，是制取软壳蟹的最佳时间。