张亚丽,高海琴

(山西省太原市中心医院,山西 太原 030009)

1 材料和方法

1.1 材料及试剂 80例肾癌组织和相应的癌旁组织(距癌组织≥1 cm)样本均取自我院2014年1月至2016年1月收治的手术患者,并经病理诊断证实。肾癌患者中男57例,女23例;平均年龄(55.3±5.5)岁;根据2009年美国癌症联合会(AJCC)TNM分期标准[7]分类,Ⅰ期17例,Ⅱ期22例,Ⅲ期26例,Ⅳ期15例。Fuhrman分级[8]:1级35例,2级37例,3级8例。采用定期复查和电话相结合的方式随访3年且随访资料完整。统计患者的总生存期(OS)。OS定义为患者从病理学确诊日期开始至死亡或末次随访日期。本研究经医院医学伦理委员会批准(批准文号:TYZZYY〔2014〕1802),患者及家属均知情同意。

人肾癌786-O细胞购自中国科学院上海细胞库。慢病毒包装的ANXA7和表皮生长因子受体(EGFR)过表达慢病毒质粒p HRi-ANXA7、p HRi-EGFR和短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达质粒p HRi-sh-ANXA7均购自上海吉玛有限公司。RPMI1640培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司;反转录试剂盒购自美国Sigma公司;Lipofectamine-3000转染试剂购自美国Vector公司;Trizol试剂盒购自Ta KaRa公司;凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司;免疫共沉淀试剂盒Anti-HA Immunopreci-pitation Kit购自Sigma公司;Western Blot试剂盒购自美国BD公司;小鼠多克隆抗体Anti-Annexin-7、兔多克隆抗体Anti-EGFR均购自美国Abcam公司。

1.2 RT-qPCR检测肾癌组织中ANXA7的表达 依据Trizol法提取各组样本的总RNA,使用引物如下:ANXA7(FP:5＇-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3＇,RP:5＇-TGTAGCCATGTAGTTGAGGTCA-3＇)。反 应 条件:75℃预变性,2 min,进入以下循环:90℃变性,5 min;60℃退火,60 s;72℃延伸,30 s;共40个循环。相对表达量用2-CT表示。每个样本独立重复实验3次。

1.3 免疫组化检测肾癌组织中ANXA7的表达 组织切片常规脱蜡和水化后置于PBS缓冲液中高压修复,然后用3%过氧化氢室温下浸泡以阻断内源性过氧化物酶,封闭,分别加稀释好的一抗4℃过夜孵育,次日复温后PBS洗涤干净,分别加稀释好的二抗,室温孵育30 min,PBS洗涤。……