饶向东，刘振宇，汤红亮，张 慧，白 雪，项梦琦，谢瑞霞，徐 龙

（1.湖北省孝昌县第一人民医院消化内科，湖北孝感 432900;2.深圳大学总医院消化内科，深圳大学临床科学研究院，深圳大学国际肿瘤中心，广东深圳 518055）

胃癌是我国常见的起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，胃癌可发病于胃窦部、胃大、小弯等处，早期胃癌表现不明显，易错过最佳治疗期，晚期胃癌患者常有腹痛、贫血、消瘦、呕血等临床表现，生存率较低，对患者的生活质量及生命安全造成较大影响[1]。胃癌病情发展复杂，与遗传因素、个体因素、环境因素等多种因素均密切相关[2]，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种微厌氧的螺旋形病菌，是胃癌、胃炎等消化系统疾病的主要感染菌，患者感染Hp 后，Hp相关的细胞毒素、酶类、细胞因子等均参与机体的不良反应，对胃黏膜病变、消化道溃疡、胃癌、胃炎等疾病的发生产生不利影响[3-4]。微小RNA是近年来发现的参与细胞增殖、肿瘤发生及转移等多种生理活动的非编码单链RNA，具有促进或抑制肿瘤发生等作用，miR-181 家族在人体细胞中广泛存在，miR-181b 是其中之一，与多种肿瘤疾病密切相关[5]。程序性细胞死亡因子4（programmed cell death factor 4，PDCD4）是近年来发现的抑癌基因，通过抑制细胞肿瘤性转化发挥肿瘤抑制作用，在胃癌组织中呈现低表达，与胃癌的发生发展密切相关[6]。本研究通过测定胃癌患者血清中miR-181b，PDCD4 表达情况，分析二者与胃癌患者Hp 感染情况之间的关系，为临床诊治胃癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2017年12月～2019年12月湖北省孝昌县第一人民医院收治的胃癌患者82例为胃癌组，其中男性42 例，女性40 例，年龄42～79 岁，平均年龄56.71±7.39 岁。同期选取本院健康体检者91 例为对照组，其中男性46 例，女性45 例，年龄40～81 岁，平均年龄58.38±8.16 岁，两组研究对象年龄、性别差异无统计学意义。纳入标准：①诊断标准参考《胃癌诊断标准》[7]；②首次确诊为胃癌；③未进行生物治疗、放疗及化疗等。排除标准：①伴有其他部位恶性肿瘤患者；②伴有严重心、肺、肝功能不全者；③伴有严重血液疾病及免疫系统疾病等；④近6 个月服用抗生素、抗炎、胃黏膜保护类药物等。本研究经医院道德伦理委员会批准通过，所有样品采集均取得患者及家属知情同意并签字，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 仪器与试剂 RNA 提取试剂盒购于美国Invitrogen 公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 购于日本TAKARA 公司；miScript SYBR®Green qPCR Kit 购于德国QIAGEN 公司；引物，由上海生工生物工程有限公司合成；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪、全自动生化分析仪购于美国Bio-Rad 公司；13C 呼气试验红外光谱仪购于安徽养和医疗器械设备有限公司；光学显微镜购于上海兆仪光电科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Hp 感染检测：采用13C 呼气试验[8]测定对照组及胃癌组受试者的Hp 感染情况，受试者空腹服用13C 尿素胶囊后30 min 通过红外光谱仪进行呼气，呼出气中13C 原子峰大于基线5% 记为Hp 感染阳性。

1.3.2 Hp 感染密度检测：参考文献[9]，采集胃癌组患者距离幽门2.5 cm 处的胃黏膜组织适量，光学显微镜中进行病理诊断，在油镜下分析Hp感染密度，Hp 轻度：样本中Hp 小于1/3；Hp 中度：样本中Hp 超过1/3 但小于2/3；Hp 重度：样本中Hp 成堆存在。对照组不进行镜检。

1.3.3 血清标本采集：采集对照组及胃癌组受试者空腹静脉血5～6 ml，室温静置20 min，4℃下3 000×g 离心10 min，采集血清至RNA 酶离心管中，-80℃冰箱保存备用，用于后续RNA的提取。

1.3.4 qRT-PCR 法测定受试者血清中miR-181b，PDCD4 的表达水平：利用RNA 提取试剂盒（Invitrogen 公司）提取血清总RNA，经过反转录得到cDNA，采用实时荧光定量PCR 法（qRT-PCR）对miR-181b，PDCD4 进行扩增。qRT-PCR 反应体系共20µl：miScript SYBR®Green Mix 10 µl，cDNA（50ng/µl）2µl，上下游引物（10µmol/L）各1µl，ddH2O 6.0µl。反应条件：95 ℃90s；95 ℃30s；62 ℃30s；72 ℃15s；共40 个循环。miR-181b，PDCD4 及内参U6，GAPDH 的引物序列见表1。采用2-∆∆Ct法对血清miR-181b，PDCD4 相对表达水平进行分析。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.4 统计学分析 采用软件SPSS 25.0 统计学分析。以均数±标准差（±s）对计量资料进行表述，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验；计数资料用n进行描述，行χ2检验；Spearman 法分析miR-181b,PDCD4 与胃癌Hp 感染的相关性。

2 结果

2.1 Hp 感染检测 对照组中79 例为Hp 感染阴性，12 例为Hp 感染阳性，Hp 感染阳性率为13.19%；胃癌组19 例为Hp 感染阴性，63 例为Hp 感染阳性，Hp 感染阳性率为76.83%；与对照组相比，胃癌组Hp 感染阳性率显著升高, 差异有统计学意义（χ2=68.571，P＜0.05）。

2.2 对照组与胃癌组血清中miR-181b，PDCD4 表达水平比较 见表2。与对照组相比，胃癌组Hp阴性、Hp 阳性患者血清中miR-181b 表达水平均显著升高（t=13.779，8.158，均P＜0.05），PDCD4 表达水平均显著降低（t=8.432，19.087，均P＜0.05），且胃癌组及对照组Hp 阳性患者血清中miR-181b 表达水平高于Hp 阴性患者（t=3.469，4.163，均P＜0.05），PDCD4 表达水平低于Hp 阴性患者（t=8.878，16.470，均P＜0.05），差异均有统计学意义。

表2 两组受试者血清中miR-181b，PDCD4 表达水平比较（±s）

表2 两组受试者血清中miR-181b，PDCD4 表达水平比较（±s）

项 目对照组胃癌组tP Hp 阴性miR-181b0.98±0.191.67±0.2213.7790.000 PDCD41.06±0.180.69±0.138.4320.000 Hp 阳性miR-181b1.19±0.232.28±0.458.1580.000 PDCD40.76±0.110.34±0.0619.0870.000

2.3 不同Hp 感染密度与血清中miR-181b，PDCD4 表达水平比较 见表3。随着胃癌患者Hp感染密度的增加，Hp 阳性患者血清中miR-181b 表达水平呈依次升高趋势（t=5.476，7.479，2.227，均P＜0.05），PDCD4 表达水平均呈依次降低趋势（t=10.216，14.014，9.199，均P＜0.05）。

表3 不同Hp 感染程度的胃癌患者血清中miR-181b，PDCD4 表达水平比较（±s）

表3 不同Hp 感染程度的胃癌患者血清中miR-181b，PDCD4 表达水平比较（±s）

注：中度组与轻度组相比，miR-181b/U6：t=5.476，P=0.000，PDCD4/GAPDH：t=10.216，P=0.000；重度组与中度组相比：miR-181b/U6：t=2.227，P=0.034，PDCD4/GAPDH：t=9.199，P=0.000；重度组与轻度组相比：miR-181b/U6：t=7.479，P=0.000，PDCD4/GAPDH：t=14.014，P=0.000。

项 目Hp 密度F P轻度（n=32）中度（n=19）重度（n=12）miR-181b/U61.87±0.372.54±0.502.98±0.598.8750.000 PDCD4/GAPDH0.48±0.090.25±0.050.11±0.0239.6440.000

2.4 胃癌患者Hp 感染与血清miR-181b，PDCD4表达水平相关性分析 Spearman 相关性分析结果显示血清中miR-181b 水平与胃癌患者Hp 感染呈正相关性，与Hp 阳性相关系数为0.659，与Hp 阴性相关系数为0.685（P＜0.001），血清中PDCD4 水平与胃癌患者Hp 感染呈负相关性，与Hp 阳性相关系数为-0.611，与Hp 阴性相关系数为-0.702（P＜0.001）。

3 讨论

胃癌是临床常见的恶性肿瘤之一，随着现代饮食结构及生活方式的改变以及环境污染加重、农药、化肥等药品的大量使用，造成胃癌发病率逐年升高，胃癌患者常会有上腹疼痛、进行性吞咽困难、呕血、黑便等不良表现，对患者的身体、心理健康及生活质量造成较大的影响[10]。引起胃癌发生的原因多样，Hp 感染是引发胃癌的重要危险因素，资料显示Hp具有调控细胞生长和分化的作用，进而引发机体的炎症反应，加剧胃黏膜损伤，从而引起癌变[11]。本研究结果显示，胃癌组Hp 感染阳性率显著高于健康体检者，提示胃癌患者中具有较高的Hp 感染阳性率，表明Hp 感染与胃癌发生密切相关，Hp 常存在于胃窦部、胃小凹等胃癌常发部位，这些部位长期受到Hp 的感染，引发癌变的几率会大大增加[12]。

miRNA 为一类具有多种生物学功能的进化保守的短序列小RNA，主要通过调节相关基因的表达作为抑癌基因或原癌基因参与机体肿瘤的发生与发展，诸多研究表明miRNA 异常表达与胃癌的发生发展联系密切[13]，资料显示miR-181 家族在胃癌、肝癌、肺癌等肿瘤的形成发展中起到重要作用，miR-181b 是其中一员，miR-181b 在胃癌组织中呈现高表达，高表达的miR-181b 对于胃癌患者的生存具有不利影响[14]。本研究结果显示，胃癌组Hp阴性、Hp 阳性患者血清中miR-181b 表达水平均显著高于对照组，且胃癌组及对照组Hp 阳性患者血清中miR-181b 表达水平高于Hp 阴性患者，提示miR-181b 可能参与了胃癌疾病的进展。

PDCD4 是近年来发现的一种肿瘤抑制基因，与胃癌、结肠癌等多种肿瘤的侵袭、转移密切相关，其在胃癌中的具体机制尚不清晰[15]。研究发现PDCD4 在胃癌患者血清中呈现低表达，且与患者的不良饮食习惯呈现相关性[16]。LI 等[17]人研究发现在高表达的miR-183 通过抑制PDCD4 的表达来促进胃癌细胞的增殖、转移等。本研究结果显示，胃癌组Hp 阴性、Hp 阳性患者血清中PDCD4 表达水平均显著低于对照组，且胃癌组及对照组Hp 阳性患者血清中PDCD4 表达水平低于Hp 阴性患者，与miR-181b 表达水平呈现相反趋势，提示PDCD4低表达可能对于胃癌疾病具有不利影响，提示miR-181b 与PDCD4 具有一定的负向调控关系，表明miR-181b 可能通过靶向PDCD4 来发挥促癌作用；随着胃癌患者Hp 感染密度的增加，Hp 阳性患者血清中miR-181b 表达水平呈依次升高趋势，PDCD4表达水平均呈依次降低趋势，Spearman 相关性分析结果显示血清中miR-181b 与胃癌患者Hp 感染呈正相关性，血清中PDCD4 与胃癌患者Hp 感染呈负相关性，表明Hp 感染可能具有一定影响miR-181b，PDCD4 表达水平的作用，可能共同参与了胃癌的发生。

胃癌的发生与多种因素相关，其发生机制复杂。本研究通过测定胃癌患者的Hp 感染情况及血清中miR-181b，PDCD4 的表达水平，发现Hp 感染程度的加深与miR-181b 表达水平的升高及PDCD4 表达水平的降低密切相关，三者的异常表达均参与了胃癌的发生及发展，但其中的潜在机制尚不清晰，仍需进一步研究。