李雪玲，颜喆，胡文锋

(华南农业大学 食品学院应用微生物研究室，广州 510642)

酱油是一种重要的传统调味食品，具有独特的风味，在亚洲国家有广泛的应用[1]。酱油除调味功能外，还具有保健功效，酱油中含有的一些生理活性物质具有抗癌、抗白内障、抗血小板凝固、抗氧化和抑制组氨酸脱羧酶的作用[2-4]。

米曲霉是一种非常重要的传统发酵微生物，特别是在酱油发酵中更具有不可估量的作用[5]。酱油酿造主要依赖于米曲霉所产生的丰富的蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多种酶系来分解原料中的多种成分，从而形成酱油独特的色、香、味、体。酱油生产米曲霉菌种的性能决定了酱油的品质及原料利用率，因此，酱油生产中选育优良的米曲霉菌株至关重要，它关系到酱油产品的产量和质量[6]。

由于各种因素的影响，譬如长期的移种和保藏，酱油生产中使用的米曲霉菌种会出现退化、变异，丢失某些重要形态特征或良好生产性能，造成生产不稳定、低产。因此，在未发生退化前就应该适时进行米曲霉菌种的复壮筛选，以保持其原有的优良性能。而传统的复壮筛选工艺流程繁琐，需要耗费大量人力、物力才能够达到预期目标。本研究在传统复壮筛选工艺的基础上，建立氨基酸态氮得率的实验模型，同时对米曲霉菌落形态特征与氨基酸态氮得率的关系也进行了大量的对比研究及验证以高效选育优良菌株，为减少复筛的工作量，提高复壮筛选的效率和质量，提升酿造酱油品质提供了一定的借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 出发菌株

米曲霉(Aspergillusoryzae)：广东珠江桥生物科技股份有限公司菌种保藏中心提供。

1.1.2 原料与试剂

面粉、豆粕、麦糠、食盐：均由广东珠江桥生物科技股份有限公司提供；化学试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

1.1.3.1 豆汁斜面培养基

大豆经低温浸泡过夜、反复加水煮汁3 h后得到豆汁，调整其浓度，加入无机盐制成豆汁斜面培养基，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3.2 酪蛋白培养基

干酪素4.00 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，Na2HPO41.07 g，KH2PO40.36 g，琼脂粉20.00 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.5～7.0，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3.3 种曲培养基

面粉20 g，麸皮80 g，水80～100 mL，250 mL三角瓶装湿料20 g，121 ℃灭菌30 min。

1.1.3.4 大曲培养基

面粉200 g，豆粕700 g，麸皮100 g，水600 mL，121 ℃灭菌20 min。

1.2 实验方法

1.2.1 制备单孢子悬浮液

将米曲霉出发菌株接种于豆汁斜面培养基，于30 ℃培养3～5 d。选取生长良好的斜面菌种，用10 mL无菌水洗下斜面上的孢子，倒入含有玻璃珠的100 mL无菌三角瓶中，磁力搅拌5 min以分散孢子，然后用血球计数板计数，进行相应梯度稀释后制成不同浓度的孢子悬浮液。

1.2.2 初筛

采用稀释平板法筛选米曲霉：吸取酪蛋白培养基置于直径9 cm的平皿中，将上述稀释至适当浓度的孢子悬浮液添加在酪蛋白平板上，用灭菌的玻璃刮板涂布均匀，于32 ℃培养箱中倒置培养72 h，每个平皿的菌落数以6～8个为宜，观察菌落形态特征，测量菌落直径(d)、透明圈直径(D)，计算K值(K=D/d)。

1.2.3 复筛1.2.3.1 中性蛋白酶活力测定

按照行业标准SB/T 10317-1999的方法测定酶活力[7]。酶活力定义：在40 ℃条件下，每1 g曲在1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位。

1.2.3.2 酱醪发酵指标测定

总酸、氨基酸态氮的检测按照GB/T 18186-2000《酿造酱油》的方法进行[8]。

1.2.3.3 孢子发芽率测定

按照行业标准SB/T 10316-1999的方法测定发芽率[9]。

2 结果与分析

2.1 米曲霉菌株的初筛

从酪蛋白平板上挑选出菌落直径d、透明圈直径(D)和K值(K=D/d)在不同范围的菌落，并记录相应菌落的孢子特征。根据d、D、K值及菌落孢子的特征将挑选出的菌落分成A，B，C，D，E，F 6个类别，每种类别选取1个典型的菌株(见表1)。将6类菌株分别接种于豆汁试管斜面，30 ℃培养72 h，菌种形态特征见图1。

表1 初筛米曲霉菌株的各项指标Table 1 The indexes of Aspergillus oryzae strainin preliminary screening

图1 初筛米曲霉菌株的菌落形态特征Fig.1 The colony morphological characteristics of Aspergillus oryzae strain in preliminary screening

由图1可知，E菌落孢子较多，菌丝致密，F菌落孢子多，菌丝薄、疏，A，B，C，D 4个菌落孢子少，菌丝稀疏。通过测定这些菌株三角瓶、制曲阶段的中性蛋白酶活以及低盐发酵放油的氨基酸态氮指标，复筛优良的米曲霉菌株。

2.2 优良米曲霉菌株的复筛

2.2.1 菌株三角瓶成曲中性蛋白酶活力的测定

将初筛挑选出的6株斜面菌种分别接种到三角瓶培养基进行扩大培养，32 ℃培养72 h，三角瓶成曲检测中性蛋白酶酶活，结果见图2。E，F两个菌株三角瓶成曲的中性蛋白酶活力明显比对照菌株高约1000 U/g，其中E菌株提高幅度较大。

图2 米曲霉复筛菌株三角瓶成曲的中性蛋白酶活力Fig.2 The activity of neutral protease of rescreened Aspergillus oryzae strain in triangular flask

2.2.2 菌株制曲中性蛋白酶活力的测定

模拟大生产条件进行小规模制曲，检测制曲成曲的中性蛋白酶活力，结果见图3。E，F两个菌株制曲成曲的中性蛋白酶活力分别为2480，2300 U/g，比对照菌株分别高13.76%和5.5%，可见通过复壮筛选能够筛选出中性蛋白酶活力显著提高的菌株。

图3 米曲霉复筛菌株制曲成曲中性蛋白酶活力Fig.3 The activity of neutral protease of rescreenedAspergillus oryzae strain in finished koji

2.2.3 复筛菌株低盐发酵放油氨基酸态氮含量的测定

按照低盐固态发酵法，将复筛挑选出的菌株做低盐发酵，检测低盐发酵总酸、氨基酸态氮，结果见图4和图5。E菌株在三角瓶、制曲阶段的中性蛋白酶活力最高，低盐发酵放油的氨基酸态氮也较高，比对照高8.4%，可见E菌株蛋白质分解能力最强，提高了原料的利用率，该菌株为选育出的优良高产菌。

图4 复筛菌株低盐发酵头油总酸含量Fig.4 The total acid content of first oil of rescreened strain by low-salt fermentation

图5 复筛菌株低盐发酵头油氨基酸态氮含量Fig.5 The amino acid nitrogen content of first oil of rescreened strains by low-salt fermentation

2.2.4 多元线性回归分析

以菌落直径d和K值为自变量，以氨基酸态氮得率为因变量，用SPSS软件建模，进行多元线性回归分析。经分析，回归方程的相关系数R=0.963，决定系数R2=0.927，经方差分析，F=19.184，P=0.020，回归方程有效，见表2和表3。

表2 回归方程方差分析表Table 2 The variance analysis of regression equation ANOVAb

表3 回归分析检验结果Table 3 The testing results of regression analysis coefficientsa

回归得到不同菌落的氨基酸态氮得率水平(U)与K值和菌落直径d之间的关系为：U=0.035d+0.332K+0.060(式1)，式中菌落直径d相当于比生长速率，K相当于单个孢子的氨基酸态氮得率系数，对于不同的菌株其比生长速率和氨基酸态氮得率系数不同，因此它们的d值和K值也不同，根据式1可以从酪蛋白平板上的菌落直径d和K值判断菌落的氨基酸态氮得率水平。

用回归方程建立模型的方法可以更准确地判断菌株的氨基酸态氮得率水平与菌落直径d和K值之间的关系，可见菌落直径和K值都相对较大时，该菌株的氨基酸态氮得率水平也较高。

2.2.5 筛选菌株菌落形态特征的回归分析

E，F两个菌株三角瓶、制曲的中性蛋白酶活力和低盐发酵放油的氨基酸态氮水平都明显比对照菌株高，其中E菌株的优势更为明显，为复筛得到的高产菌株。

由表1和图1可知，E，F两个菌落孢子都比较多，但F的菌丝不如E的致密、厚，由此可见初筛挑选菌落时，要将菌落直径、K值和菌落形态特征三者结合起来作为评价标准，重点挑选孢子多和菌丝致密、厚的菌落，采用此评价标准可以大大提高菌株筛选的效率和准确性。

2.2.6 优良菌株稳定性研究

将E菌株进行5次斜面传代，每一代斜面菌种同时接种于三角瓶种曲培养基中进行菌种培养，每传代一次检测三角瓶菌种的中性蛋白酶活力和发芽率[10]，结果见图6和图7。

图6 优良菌株的遗传稳定性Fig.6 The genetic stability of superior strains

图7 优良菌株的连续传代的发芽率Fig.7 The germination rate of continuous passage of superior strains

由图6可知，E菌株经过5代连续传代培养，其三角瓶成曲的中性蛋白酶活力均保持在7900 U/g以上，而且酶活力变化不大，该菌株保持了较好的产酶稳定性[11]，每一代的酶活力都优于出发菌株(酶活7014 U/g)。由图7可知，三角瓶成曲的发芽率均保持在94.0%以上，每一代的发芽率都优于出发菌株(发芽率89.6%)，综合复筛与遗传稳定性实验结果可知该菌株同时拥有较高的酶活力与稳定的遗传稳定性[12]。

3 结论

该研究通过酱油酿造优良米曲霉菌株的初筛和复筛，选育出E菌株为高产优良菌株，该菌株在三角瓶、制曲阶段的中性蛋白酶活力以及低盐发酵放油的氨基酸态氮指标都具有明显的优势。在此基础上建立了米曲霉氨基酸态氮得率的筛选模型，得到了氨基酸态氮得率与K值和菌落直径d的关系，建立回归方程U=0.035d+0.332K+0.060，米曲霉氨基酸态氮得率的高低可以通过酪蛋白平板上的菌落直径大小和K值来确定，菌落直径和K值都相对较大时，该菌株的氨基酸态氮得率水平也较高，通过菌落直径d和K值可以初步判断菌株发酵放油的氨基酸态氮水平，减少了复筛的工作量，提高了复壮筛选的效率和准确性。

研究结果表明，可以通过酪蛋白平板上的菌落形态特征判断菌株的产酶能力和发酵放油的氨基酸态氮水平，一般菌落孢子较多、菌丝较厚的菌株产酶能力强，氨基酸态氮得率高，将K值和菌落直径结合起来挑选菌株，采用此方法选育菌株，选育准确性和效率都较高。

筛选出的优良菌株的传代稳定性是重要的参考标准，如果菌株在传代过程中的酶活迅速降低，证明筛选出的菌株很容易退化。

采用蛋白酶活力高的优良菌株酿造酱油，不仅可以提高原料的利用率，而且能减少酿造工业的污染。采用米曲霉氨基酸态氮得率的筛选模型选育高效优良的菌株，可以为实际生产中制曲菌种的选择提供依据，并为制曲菌株的选育研究提供参考。