何 潇 刘 兴 辛正琦 谢海艳 辛余凤 吴能表,*

半夏基因的克隆、表达与酶动力学分析

何 潇1,2刘 兴3辛正琦1,2谢海艳1,2辛余凤1,2吴能表1,2,*

1西南大学生命科学学院, 重庆 400715;2三峡库区生态环境教育部重点实验室, 重庆 400715;3重庆市大足中学, 重庆 402360

本研究以半夏为研究对象, 基于其转录组数据克隆获得1个苯丙氨酸解氨酶基因, 命名为, 通过DNAMAN、MEGA等生物信息学软件进行序列结构与系统进化分析表明, 该基因核酸序列长度为2289 bp, 编码762个氨基酸, 终止密码子为TAA, PtPAL与单子叶植物百合PAL相似度达78%, 具有PAL-HAL、PLN02457、phe_am_lyase、Lyase_aromatic及HutH结构域, 属于苯丙氨酸解氨酶家族成员(Lyase_I_like Superfamily)。半夏PtPAL与单子叶植物百合、菠萝和油棕亲缘关系较近, 归于单子叶植物。采用实时荧光定量PCR分析在不同组织间的表达情况表明,基因在叶中表达量最高, 其次是块茎和根, 花中表达量最低。通过对半夏基因进行功能表达分析发现, PtPAL重组蛋白可以高效催化L-Phe生成-CA, 且催化反应最适pH与温度分别为9.0、70℃; PtPAL的m、max、cat和cat/m分别为0.89 mmol L-1、63.96 nKat mg–1、6.56 s–1和7.37×103s–1M–1。进一步探究金属离子对PtPAL酶活性的影响表明, Ba2+显著增强了PtPAL酶活性, Mn2+、Co2+、Cu2+及Zn2+抑制了PtPAL酶活性。本研究为进一步研究的功能特点及半夏苯丙胺类生物碱代谢途径奠定基础。

半夏; 麻黄碱; 苯丙氨酸解氨酶; 基因克隆; 表达分析; 酶动力学分析

半夏源于天南星科植物半夏()的干燥块茎, 属于多年生草本植物, 是我国传统中药材, 其药用功效为燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结。现代研究发现半夏含有众多化学成分, 主要包括生物碱、黄酮类、甾醇类、挥发油、芳香族成分、有机酸类、半夏蛋白、鞣质以及多种微量元素等, 其中, 生物碱为半夏药理作用的主要有效成分之一[1]。……