李春萍，邱轶辉，夏厚胤，谭璐娜，许环宇，张瀚文，高景慧

(西北农林科技大学草业与草原学院， 陕西 杨陵 712100)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是畜禽最重要的蛋白质饲草，主产区集中于我国西北干旱、半干旱地区，当地气候干燥、降水较少。苜蓿特有的蒸腾系数高、水分散失快的生物学特性，是制约苜蓿主产区草产量提升的重要原因[1]。与国际育成品种相比，我国现有的苜蓿育成品种具有抗逆(寒冷、盐碱和病虫害)、耐牧及高产优质的特点，但品质及产草量仍有大幅提升空间，尤其是西部主产区的苜蓿推广品种[2]。突破高产优质苜蓿品种的生物学限制，提高其生物抗旱能力，成为了我国西北主产区苜蓿品种改良的重要目标。

近年来紫花苜蓿的常规育种技术多集中于选择育种，主要为轮回选择和混合选择。杂交育种是作物育种中使用次数最多、育成品种最全、获得成果最广泛的育种技术。苜蓿品种的杂交选育，同样取得了不错的效果[3]。研究表明，苜蓿通过品种间的杂交，可显著提高其生产性能[4]；紫花苜蓿和黄花苜蓿间远缘杂交，其杂交后代的产草量显著高于无性系[5]；Wagner和Velde[6]选育出的杂交苜蓿品种‘HybriForce-3400’，与品种‘55V50’(叶片含量45.0%)相比，叶片含量增加至48.8%；陈晶晶等[7]提出不同紫花苜蓿杂交，有望筛选出抗寒、优质的紫花苜蓿品种；乌云塔娜等[8]研究了苜蓿不育系杂交组合组配间的光合蒸腾特性，认为苜蓿水分利用效率与杂种优势存在一定的关系。苜蓿是喜水植物，在保证产量的同时消耗大量水分，面对我国水资源短缺的状况，如能解析苜蓿的生物节水机制及相关性状，以此对高产优质苜蓿品种进行针对性抗旱筛选，可为高产优质苜蓿品种的抗旱性改良提供新的科学思路及其选育方法。

本试验基于多父本杂交技术，对苜蓿的F1代进行蒸腾特性、农艺性状观测及抗旱性鉴定，并以品质性状和产量性状为主要筛选条件，利用隶属函数法，综合评定紫花苜蓿多父本杂交后代低蒸腾下高产的可能性，探索减少苜蓿过度蒸腾达到生物节水的方法，以期为进一步选育适宜我国西部地区推广种植的高产抗旱苜蓿品种提供新的筛选方法和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地点为西北农林科技大学草业科学系试验田(34°29′ N，108°07′ E)。该地属东亚暖温带半湿润半干旱气候区，大陆性季风型气候特征；海拔514 m，年均温12.9℃，年降雨量660 mm，年日照时数2 163.8 h，干燥度1～1.6，无霜期221 d；土壤pH为7.03，有机质含量为0.82%，总氮含量为1.05 mg·g-1，总磷含量为1.28 mg·g-1。

1.2 试验材料

以试验地种植的紫花苜蓿多父本自由授粉，同一品种母本混合收获的F1代种子为材料。根据前人的研究，选择具有相关优良性状的苜蓿品种作为多父本杂交亲本：‘武功’(Wugong)、‘三得利’(Sanditi)、‘赛迪10’(Sardi10)、‘陇南1号’(Longnan No.1)、‘WL168HQ’、‘WL343HQ’、‘WL656HQ’、‘WL712’、‘WL903’，种植图见图1。‘WL168HQ’、‘WL712’、‘WL903’具有抗旱性强的特点[9-10]；‘武功’、‘三得利’、‘赛迪10’、‘WL343HQ’、‘WL656HQ’、‘WL903’产草量高；‘WL656HQ’和‘WL903’还具有分枝多的特点[11-13]。

图1 亲本种植图

实验室挑选健康饱满的F1代种子，以15%的次氯酸钠(NaClO)消毒10 min后用无菌水冲洗3遍。种子以1/2MS(Murashige and Skoog)固体培养基培养，置于25℃人工气候培养箱中。待两片子叶完全展开时选择健康、生长一致的幼苗移入培养盆置于冬春季室外自然条件下继续培养，选出12个株系作为本试验材料，其母本为抗旱性强、产草量高的‘WL903’和‘Sardi10’。初花期(盆栽)测定12个株系单株(每个株系各1株)的相关指标，详见表1。

1.3 测定指标与方法

1.3.1株高 用直尺(精度为0.1 cm)测量所选株系的绝对高度，每株自土表至最长枝条的顶芽。

1.3.2节间数 分别计量各株系单株植株全部枝条从基部到顶端的节间数。

1.3.3一级分枝数 参照魏臻武的方法[14-15]，从根颈处计量各株系单株的一级分枝数目。

1.3.4叶面积 分别对每株苜蓿植株随机选取10片三出复叶，应选取大小相近、发育良好、健康的叶片，测量每个小叶的长、宽。以三出复叶的3个小叶的长×宽的均值表示每片三出复叶的功能叶面积，每株测量10片三出复叶取平均值。

1.3.5叶片失水率与叶片含水量 根据曹宏等[16]的方法采集植株顶端发育良好的10片三出复叶，迅速在0.0001 g电子天平上称重记录初始重量，置于室温下，测定采集后1 h，2 h，4 h，8 h的重量，最后置于烘箱65℃烘干24 h至恒重，称量叶片干重。分别对每组叶片的各个测量时刻按照公式(1)计算当时的叶片失水率。根据公式(2)计算叶片含水量。

叶片失水率=(初始重量—当前重量)/初始重量×100%

(1)

叶片含水量=(初始重量—叶片干重)/初始重量×100%

(2)

1.3.6聚乙二醇-6000(polyethylene glycol-6000，PEG-6000)处理下的枝条失水率 每株植株取2根靠近顶端的长度约10 cm的枝条，分为处理组和对照组。取下的枝条应发育良好，叶片生长整齐、健康，称重记录为m1后放置于1/2MS液体培养基中静置3.5 h，使枝条适应培养基渗透压后快速擦干枝条上的水分称重记录为m2，将对照组重新放回1/2MS液体培养基中，将处理组中的枝条移至用1/2MS配置的15%PEG-6000溶液中处理3.5 h。擦干枝条上的水分后对处理组和对照组分别称重记录为m3，按照公式(3)计算枝条失水率，按照公式(4)计算相对失水率。

枝条失水率=(m2—m3)/m1×100%

(3)

式中：m2为枝条适应后的重量；m3为枝条处理后的重量；m1为枝条刚离体时的重量。

相对失水率=处理组的枝条失水率—对照组的枝条失水率

(4)

1.3.7隶属值 利用公式(5)计算各个指标的隶属值[17]。

R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(5)

式中：Xi为指标测定值，Xmin和Xmax为所有参试材料某一指标的最小值和最大值。

如果为负相关，则按照公式(6)计算。

R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(6)

1.4 统计方法

本试验数据采用SPSS 2020和Excel 2016进行分析，使用单因素ANOVA分析不同株系叶面积及失水性的差异，多重比较采用新复极差法，作图用GraphPad Prism 8.0.2，利用隶属函数分析法综合评价。

2 结果与分析

2.1 F1代不同株系产量相关性状的分析

苜蓿的分枝数和节间数在一定程度决定产草量，对苜蓿产量优势的形成具有重要影响[18]。由表2可知，在杂种F1各株系中，WL903-2#的分枝数(13个)、节间数(67个)最多，分枝数高于均值(6.8个)90.2%，节间数高于均值(34.7个)93.3%；Sardi10-4#分枝数(4个)最少，WL903-3#节间数(16个)最少。叶面积与苜蓿的产量和光合作用息息相关，影响苜蓿的适口性。表2表明，Sardi10-4#(428.4 mm2)和Sardi10-5#(489.5 mm2)的叶面积明显高于另外9个株系(P<0.05)。株高与苜蓿的干草产量呈正相关[19]。盆栽条件下，Sardi10-5#的株高(53.5 cm)最高，其余各株系均明显低于Sardi10-5#。

表2 F1代不同株系杂交种的株高、节间数、分枝数及叶面积分析

2.2 F1代不同株系蒸腾失水性分析

叶片含水量是评价植物抗旱性的重要指标。在本次供试的材料中，各株系叶片含水量无显著差异(图2)，12个株系的叶片含水量均值为84.7%，WL903-1#—WL903-4#和Sardi10-4#叶片含水量低于均值，其余7个株系叶片含水量高于均值。含水量最高的株系是WL903-7#，为87.7%，WL903-3#(81.1%)含水量最低。

图2 F1代不同株系杂交种的叶片含水量比较

植物水分散失的主要途径是蒸腾作用，气孔蒸腾是植物蒸腾作用的最主要方式。离体叶片水分的散失情况在很大程度上反映了整体植株的水分状态，离体叶片失水率反映了其保水能力，即叶片组织抗脱水的能力，叶片失水率越低的植株，具有的抗旱能力就越强[20]。本试验中不同时间段下，12个株系叶片失水率如图3所示，离体2 h时，株系WL903-3#和WL903-4#的失水率显著低于其他株系(P<0.05)，离体8 h时株系WL903-5#和Sardi10-2#的失水率，则显著高于其他株系(P<0.05)。

图3 F1代不同株系叶片自然失水率比较分析

模拟干旱胁迫下，12个株系的枝条失水率都显著高于对照组(图4)。对照组除株系WL903-3#、WL903-4#和Sardi10-5#外，其余各株系失水率均为负值，说明大部分株系可适应1/2MS环境并吸收其中的水分。15% PEG-6000处理下，Sardi10-4#枝条失水率(6.8%)最低，WL903-2#枝条失水率(13.4%)最高，且两者之间差异极显著(P<0.01)。

图4 15% PEG-6000处理下F1代不同株系枝条失水率分析

在所有供试材料中(图5)，WL903-4#枝条相对失水率(5.8%)最低，显著低于其他11个株系(P<0.05)，与相对失水率最高的WL903-2#(17.5%)比较差异极显著(P<0.01)。此外，Sardi10-4#和Sardi10-5#的相对失水率也较低，分别为8.2%，9.2%。

图5 15% PEG-6000处理下F1代不同株系枝条相对失水率比较

2.3 杂交F1代株系的综合评价筛选

按照公式(5)和公式(6)计算隶属值，本试验主要根据产量性状和抗性性状进行筛选，分别对株高、节间数、分枝数、叶面积、叶片失水率、枝条相对失水率6个指标分别赋予0.2，0.1，0.1，0.2，0.2，0.2的权值，其结果如表3所示。其中性状综合评价最好的为Sardi10-5#株系。各株系性状综合表现顺序为：Sardi10-5#>Sardi10-4#>WL903-4#>Sardi10-1#>WL903-2#>WL903-1#>WL903-6#>WL903-7#>Sardi10-2#>WL903-3#>Sardi10-3#>WL903-5#。

表3 12个杂交F1代株系农艺性状和抗性性状综合比较分析

3 讨论

3.1 隶属函数分析与多父本杂交早代的筛选

如果能在杂交早代精准确定苜蓿性状及其表型，则对品种后期筛选极其便利。种质材料的综合评价不仅需要适宜的评价指标，还需要适宜的评价方法[21]。隶属值函数分析可有效解决单一数据不能够客观、有效评价样本综合素质的问题[22]，梁欢等[23]基于生理及生长的隶属值函数分析，成功完成紫花苜蓿的抗旱性评价。针对本试验多父本杂交早代精准筛选需求，试验根据生产上高产抗旱品种的选育目标，对株高、节间数、分枝数、叶面积、失水率等6个生理及农艺性状分配合理的权值，通过隶属值函数综合性分析，达到了对紫花苜蓿多父本杂交早代低蒸腾精准筛选的目的。

3.2 低蒸腾苜蓿产量性状的抗旱性能筛选

紫花苜蓿作为我国西北地区最重要的一种栽培牧草，其产量与品质广泛影响到我国的畜牧业发展。随着国内经济的不断发展，为满足畜牧业不断增长的需求，我国对优质紫花苜蓿干草的需求也不断增加。紫花苜蓿株高、分枝数、节间数、叶面积等农艺性状是衡量苜蓿产量的重要指标。潘香逾等[24]研究表明，苜蓿鲜草产量和干草产量都与株高、根茎分枝数显著正相关。苜蓿株高一定时，节间数越大产生的叶片越多，同孟昭仪[25]的结论“节间伸长造成叶量相对减少”一致。叶面积是衡量叶片光合作用制造有机物的能力的指标，叶面积越大，越有利于提高苜蓿产量[26]。

曾泽堂等[27]比较我国西北地区广泛种植的3个品种的紫花苜蓿，发现‘甘农1号’紫花苜蓿的抗旱性较好，但产量性状并不十分理想。张则宇等[28]对59份苜蓿种质材料进行评价筛选，综合筛选出耐盐性极强的材料‘美11’、‘中苜1号’、‘爱开夏’和‘中苜3号’。然而在我国共计77个登记品种中[2]，同时具有高产、抗旱特性的品种较少。在干旱条件下，紫花苜蓿通过改变自身叶面表皮蜡质调控水分散失，通过提高根系长度和根系体积来获取更多水分[29]。气孔影响苜蓿蒸腾作用[30]，其开度和密度与苜蓿的抗旱能力有一定相关[31]。为此，Jin等[32]利用H2来调节苜蓿气孔敏感性来提高苜蓿的抗旱能力，包爱科等[33]转入旱生植物相关基因改变苜蓿气孔运动与蒸腾作用，获得了很好的抗旱苜蓿新品系，为利用现代生物技术，来提高苜蓿抗旱性提供了思路。紫花苜蓿高蒸腾特性，一直阻碍着我国苜蓿主产区的高产栽培。异花繁殖的紫花苜蓿进行多父本杂交，可以使后代具有广泛的遗传基础，极有可能从中筛选出低蒸腾、生物节水型苜蓿抗旱种质。本试验通过自然控制蒸腾速率，结合自然失水和干旱胁迫(15% PEG-6000)鉴定，从苜蓿多父本杂交F1代中，筛选出低蒸腾并具有高产潜力的株系，说明可能可以利用植物的生物节水，筛选高产抗旱苜蓿品种。

4 结论

基于隶属值函数分析，通过对多父本杂交F1代产量性状和抗旱能力的综合评价，初步筛选出低蒸腾、高产苜蓿株系Sardi10-5#和Sardi10-4#。