零 晨，石巧芳，张晶晶，韦展鹏，庞 可，裴继影,2

(1.广西大学海洋学院，广西 南宁 530000；2.广西南海珊瑚礁研究重点实验室，广西 南宁 530000)

PM2.5是指空气动力学等效直径等于或小于2.5 μm的大气细颗粒物，具有质量轻、比表面积大、吸附性强等特点，易吸附细菌、病毒等物质，且在大气中滞留时间长，可造成大范围的空气污染。近年来，随着经济的高速发展，工业废气和汽车尾气排放量不断增加，大气PM2.5污染导致的一系列问题受到人们的关注。流行病学研究发现，PM2.5影响呼吸系统、心血管系统、免疫系统、神经系统等，能够导致急性心肌梗[1]、早产儿及新生儿死亡率增加[2-4]、癌症[5-6]等疾病的发生。醌类化合物是细颗粒物中苯系物及多环芳烃(PAH)的重要衍生产物，通过自身氧化还原可产生活性氧自由基，危害人类健康，同时具有急性毒性、免疫毒性和致癌毒性。

目前，醌类化合物的检测方法有化学发光法[7]、荧光法[8-10]、毛细管电泳分离法[11]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS)[12-14]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[15]等。然而，这些方法通常需要复杂的样品前处理过程，不仅耗时、耗力，且需要大量的有机试剂，对环境造成二次污染。因此，亟待开发一种快速、廉价、高效的方法用于PM2.5中醌污染物的检测。

2004年，Cooks等[16]在电喷雾离子化技术的基础上开发了解吸电喷雾离子化技术(DESI)，并首次提出了敞开式大气压离子源[17]的概念。此后，短短几年间相继出现了30多种常压敞开式离子源，如实时直接分析(DART)[18]、萃取电喷雾离子源(EESI)[19-20]、文丘里超声喷雾离子源(EASI)[21]、激光剥蚀电喷雾离子源(LAESI)[22-23]等，这些常压敞开式质谱无需或仅需简单的样品前处理步骤，即可在环境下对样品进行直接分析。2010年，Cooks等[24]开发了纸喷雾离子源(paper spray)，不仅具有一般常压电离源的特点，同时具有易获取、低廉的特性，现已广泛用于环境[25-27]、血液[28-29]、尿液[30]、食品[27, 31]及生物组织[32-35]等样品的分析检测。

本研究拟建立纸喷雾离子化衍生质谱法检测PM2.5中1,4-苯醌(BQ)、甲基对苯醌(MBQ)、1,4-萘醌(NQ)、1,4-蒽醌(AQ)等4种醌类污染物。通过优化巯基试剂、电压、喷雾溶剂种类等实验条件，以及使用线性、检出限等指标评价分析性能，将该方法应用于PM2.5实际样品中醌类污染物的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

LTQ XL二维线性离子阱质谱仪：美国赛默飞世尔科技公司产品，配有Xcalibur 4.1数据处理系统；FA1104型电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司产品；KQ-100DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；Vortex-Genie2型漩涡混合器：美国Scientific Industries公司产品；Milli-Q纯水仪：美国Millipore有限公司产品。

1.2 材料与试剂

3 mm色谱层析纸：英国Whatman公司产品；1,4-苯醌、甲基对苯醌、1,4-萘醌、1,4-蒽醌：上海安谱实验科技股份有限公司产品，其化学结构式列于表1；半胱胺：北京百灵威科技有限公司产品；半胱氨酸、谷胱甘肽：上海生工生物工程股份有限公司产品；甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯：均为LC级，美国Honeywell Burdick ®Jackson公司产品；超纯水：由Milli-Q纯水仪制备。无特别说明试剂均未进行任何提纯处理。

表1 醌类化合物及其衍生产物的结构以及衍生产物的特征碎片离子Table 1 Structures of quinones and their derivatives, and characteristic fragment ions of derivatives

色谱纸预处理：在45 ℃下，将色谱纸浸泡在10-3mol/L HNO3溶液中3 h，用超纯水清洗5次后放入70 ℃烘箱中烘干，储存于常温、干燥的密封环境。

1.3 溶液制备

4种醌母液的制备：将4种醌溶于乙腈溶液中，制备成1 000 mg/L溶液，于-20 ℃储存待用；半胱胺母液的制备：将半胱胺溶于乙腈溶液中，制备成1 000 mg/L溶液，于-20 ℃储存待用；半胱氨酸母液的制备：将半胱氨酸溶于水中，制备成1 000 mg/L溶液，于-20 ℃储存待用；谷胱甘肽母液的制备：将谷胱甘肽溶于甲醇-水溶液(4∶1，V/V)中，制备成1 000 mg/L溶液，于-20 ℃储存待用。其他不同浓度的溶液无特别说明均使用乙腈稀释。

1.4 实验条件

1.4.1质谱条件 毛细管入口温度275 ℃；串联质谱碰撞气体为氦气，碰撞诱导解离能量为25%，采集时间为30 ms；在碰撞池中，母离子的隔离宽度为1.0；实验中其他参数均为质谱仪默认值。所有质谱图均在正离子模式下得到，使用Xcalibur 4.1软件处理。

1.4.2离子源条件 自制ESI源：将喷雾电压加在注射器针头上，施加3 kV高压；注射器中的醌与衍生试剂反应溶液流经1根长约50 cm的熔融石英毛细管(内径100 μm，外径365 μm)，由刻蚀毛细管的尖端流出，喷针尖端距质谱入口1 cm，流速2 μL/min；外层毛细管为不锈钢管(内径500 μm，外径1.59 mm)，用于鞘气流出、辅助溶剂雾化及样品离子化，鞘气为N2，设定值为3 MPa。

纸喷雾离子源：将色谱纸剪成底10 mm，高8.66 mm的等边三角形，用不锈钢夹夹住纸片的底边；纸尖端距质谱入口5 mm。实验过程中，先将2 μL样品滴至色谱纸上，再用移液枪加入5 μL衍生试剂。施加高压后，仪器开始记录数据，同时在色谱纸上滴加喷雾试剂，整个衍生化反应持续时间约20 s。每完成1个样品更换1个新的三角形纸片，避免交叉污染。纸喷雾离子化衍生质谱法测定PM2.5中醌的示意图示于图1。

图1 纸喷雾离子化衍生质谱法测定PM2.5中醌Fig.1 Diagram of derivative-based paperspray ionization mass spectrometry for quinone determination in PM2.5

2 结果与讨论

2.1 实验条件优化

2.1.1衍生试剂选择 醌是一种弱极性化合物，在电喷雾过程中离子化效率较低，使用巯基试剂与其进行衍生反应，可在醌的分子结构中引入1个结合质子能力较强的氨基，从而提高离子化效率。因此，巯基试剂种类是决定衍生反应效率的关键因素，本实验选取半胱胺、半胱氨酸、谷胱甘肽作为衍生化试剂进行考察。由于纸喷雾和电喷雾离子源的离子化机制相似[36]，电喷雾离子源的重复性比纸喷雾好，故巯基试剂种类的优化实验在电喷雾离子源上进行，以得到更准确、可靠的结果，示于图2。可见，NQ和AQ与半胱胺反应的产物信号强度远高于与谷胱甘肽和半胱氨酸；BQ与谷胱甘肽反应的产物信号强度最高，分别约为与半胱氨酸和半胱胺的5倍和2.5倍；MBQ与3种巯基试剂反应的产物信号强度相当。综上，半胱胺作为衍生化试剂与4种醌反应产物的离子化效率最优，因此，后续实验选择半胱胺作为衍生化试剂。

注：误差线代表3次重复实验的标准偏差图2 巯基试剂衍生物质谱信号强度对比Fig.2 Comparison of intensity of sulfhydryl reagents

2.1.2纸基质修饰和碎片离子解析 色谱纸表面与样品中极性化合物间存在较强的相互作用力，导致目标化合物难以在较短时间内洗脱，降低了纸喷雾质谱的分析性能；另外，色谱纸中的杂质会严重抑制目标化合物的离子化。有研究[37]表明，使用硝酸对纸基进行修饰能有效消除化学杂质干扰。用处理前、后的色谱纸分析4种醌，结果示于图3。经硝酸处理后的色谱纸，纸喷雾中目标化合物的信号强度较高，且背景峰的数量明显减少。因此，在色谱纸使用前，用10-3mol/L硝酸溶液对其进行处理，然后对4种醌进行纸喷雾离子化衍生质谱分析，其全扫描和二级质谱图示于图4。BQ、MBQ、NQ和AQ与半胱胺反应产生的母离子([M+H]+)分别为m/z186、200、234、284，结构列于表1。二级质谱分析中，4种醌衍生产物的共同碎片离子为[M-17]+，即脱氨峰；此外，NQ和AQ衍生产物的碎片离子还包括[M-34]+和[M-60]+，推测结构分别为[M-H2S]+和[M-CH2CH2SH]+。基于此特征碎片峰，推断NQ和AQ与半胱胺反应时，通过氨基进攻羟基邻位碳原子发生成环反应，而BQ和MBQ与半胱胺反应时未发生该反应。

图3 正离子模式下，使用未处理(a)和处理后(b)色谱纸的全扫描质谱图Fig.3 Full scan mass spectra of untreated (a) and treated (b) chromatographic paper in positive ion mode

注：Cys代表半胱胺；二级质谱图中碰撞诱导解离能量均为25%图4 正离子模式下，纸喷雾离子化衍生质谱法检测BQ、MBQ、NQ和AQ的全扫描(a)和二级(b～e)质谱图Fig.4 Full scan mass spectrum (a), MS/MS spectra of BQ (b), MBQ (c), NQ (d) and AQ (e)by derivative-based paper spray ionization mass spectrometry in positive ion mode

2.1.3电压优化 电压会影响纸喷雾离子化效率，当电压过小时，溶液在色谱纸尖端无法形成泰勒锥，进而无法发生离子化；电压过大时，色谱纸尖端容易产生放电现象，不仅会影响分析物的离子化效率，而且会对仪器造成损害[38-39]。因此，本实验选择3、3.5、4、4.5、5 kV进行优化，其结果示于图5。可以看出，4种醌对于电压的变化趋势一致，当电压为5 kV时，信号强度最高；继续增大电压会产生电晕放电，损害仪器，且导致样品测试重复性较差。故选择5 kV电压进行后续实验。

注：误差线代表6次重复实验的标准偏差图5 电压对BQ、MBQ、NQ和AQ衍生产物信号强度的影响Fig.5 Effect of voltage on signal intensity of BQ, MBQ, NQ and AQ derivatives

2.1.4喷雾溶剂选择 目标化合物在喷雾溶剂中的溶解度会影响其在纸喷雾离子源中的离子化效率。本实验考察了含0.1%甲酸的乙腈溶液、含0.1%甲酸的乙腈-乙醇溶液(V/V，1∶1)、含0.1%甲酸的乙腈-甲醇溶液(V/V，1∶1)、含0.1%甲酸的乙腈-乙酸乙酯溶液(V/V，1∶1)等4种溶剂对检测效果的影响，结果示于图6。可以看出，对于BQ、MBQ和AQ，乙腈和乙腈-乙醇混合液作为喷雾溶剂时的离子化效率接近，信号强度高于其他2种喷雾溶剂，但乙腈的重复性优于含0.1%甲酸的乙腈-乙醇溶液；对于NQ，乙腈的离子化效率最好，强度远高于其他3种溶剂。综合考虑，后续实验选择乙腈作为喷雾溶剂。

注：误差线代表6次重复实验的标准偏差图6 喷雾溶剂对BQ、MBQ、NQ和AQ衍生产物信号强度的影响Fig.6 Effect of spray solvent on signal intensity of BQ, MBQ, NQ and AQ derivatives

2.2 分析性能表征

在最佳实验条件下，即选择半胱胺作为衍生化试剂、乙腈作为喷雾溶剂、电压设置为5 kV，对该方法的分析性能进行表征。常压敞开式质谱面临的挑战主要为重复性差和定量能力弱[40]，为减小操作条件变化对分析误差造成的影响，采用内标法进行定量。由于要求内标化合物结构和目标分析物结构尽可能相似，因此选择BQ-D4作为BQ和MBQ分析的内标化合物，1,4-NQ-D6作为NQ和AQ分析的内标化合物，定量分析标准曲线示于图7。可见，在0～100 mg/L浓度范围内，4种醌的信号强度呈现较好的线性关系，BQ、MBQ、NQ、AQ的线性相关系数(R2)分别为0.990、0.993、0.992和0.990。基于11次空白值的标准偏差，采用3倍标准偏差与标准曲线斜率的比值作为检出限，即3×δblank/k，其中，δblank为11次空白值的标准偏差，k为标准曲线的斜率，计算得到BQ、MBQ、NQ、AQ的检出限分别为4.49、20.89、0.13和1.71 ng。

2.3 纸喷雾离子化衍生质谱法原位检测PM2.5中的萘醌和蒽醌

将该方法应用于PM2.5实际样品检测中，在采集PM2.5样品的石英滤膜上分别加入0、50、100、200、500、1 000 μL的NQ和AQ母液(1 000 mg/L)，萃取后利用纸喷雾离子化衍生质谱法测定NQ和AQ的含量，结果示于图8～10。空白实验中(萃取溶液中未加入NQ和AQ溶液)，未检测到4种醌的衍生化产物，示于图8，表明该样品中醌含量在检出限以下，且环境大气对实验结果没有影响。PM2.5样品采集于广西大学校园，远离工厂排放、煤炭燃烧等污染源，所以样品中NQ和AQ含量较低。对于加标的PM2.5样品，由纸喷雾离子化衍生质谱法可得到较好的定性和定量结果，示于图9～10，其中，NQ和AQ的线性相关系数R2分别为0.980、0.997。根据文献[41-43]报道，大气中NQ的浓度为

注：BQ-D4作为BQ和MBQ定量分析的内标化合物；1,4-NQ-D6作为NQ和AQ定量分析的内标化合物；误差线代表6次重复实验的标准偏差图7 纸喷雾离子化衍生质谱法定量分析BQ (a)、MBQ (b)、NQ (c)和AQ (d)的标准曲线Fig.7 Linear dynamic curves for BQ (a), MBQ (b), NQ (c) and AQ (d) determination with the developed derivative-based paper spray ionization mass spectrometry

图8 正离子模式下，纸喷雾离子化衍生质谱法在空白实验中的全扫描质谱图Fig.8 Full scan mass spectrum of the blank control by derivative-based paper spray ionization mass spectrometry

注：1,4-NQ-D6作为内标化合物；误差线代表6次重复实验的标准偏差图10 纸喷雾离子化衍生质谱法定量分析PM2.5中NQ(a)和AQ(b)的标准曲线Fig.10 Calibration curves for NQ (a) and AQ (b) determination in PM2.5 by derivative-based paper spray ionization mass spectrometry

注：Cys代表半胱胺；PM2.5样品中NQ和AQ的加标量均为40 ng图9 正离子模式下，纸喷雾离子化衍生质谱法分析PM2.5中NQ和AQ的总离子流图(a)、全扫描质谱图(b)和二级质谱图(c～d)Fig.9 Total ion chromatogram (a), full scan (b) and MS/MS spectra (c-d) of NQ and AQ in PM2.5 by derivative-based paper spray ionization mass spectrometry

3 结论

本研究建立了一种快速、低廉、省时省力的纸喷雾离子化衍生质谱法用于PM2.5中醌污染物的测定。在最优实验条件下，以半胱胺为衍生化试剂、电压5 kV、乙腈为喷雾溶剂时，BQ、MBQ、NQ和AQ的检出限分别为4.49、20.89、0.13和1.71 ng。此外，通过分析PM2.5中的NQ和AQ，均获得了较好的定性和定量效果。