门亚玲, 王祝惠子

(咸阳职业技术学院,陕西 咸阳 712000)

近几年我国花生产量超过1 700万t,花生产量和单产位居世界第一,花生消费整体保持稳定增长态势.我国花生出口贸易在世界花生贸易中占有重要地位,国际贸易以出口为主,进口为辅[1].因此,花生是我国重要的经济油料作物和出口创汇农产品之一[2].而在食品工业中,为保证产品的风味不受花生皮的涩味影响,往往会将花生皮去掉.相关研究表明,花生皮中含有大量的高抗氧化剂、花青素、儿茶素、表儿茶素和花青素等具有商业价值的物质[1—2].其中多数抗氧化剂可降低患心血管疾病和癌症、糖尿病、炎症的风险[3],所以探究低成本高效率地从花生皮中提取有益物质具有一定意义.

超临界二氧化碳提取工艺由于其萃取过程结束后无萃取剂残留的特性被广泛应用于油、生物活性化合物及抗氧化剂等的萃取[4].此外，由于超临界二氧化碳萃取在食品加工中具有许多优势,如其临界温度和压力很低(304 K和7.1 MPa)且与常规提取法(如索氏提取法)相比其提取物具有很高的生物活性和抗氧化活性,所以成为了近年的研究热点[5—6].许多研究人员已成功地使用超临界二氧化碳萃取工艺从草药和植物中有效提取了生物活性化合物[7—8].近年来,科研人员通过超临界二氧化碳萃取工艺成功地提取了吉林果种子、棕榈油和橡胶籽油中的有益物质[9].对某些化合物和溶质条件的高选择性和扩散性是超临界二氧化碳提取工艺的显著优点[10—11].

此外,超临界二氧化碳提取工艺的另一个优点是可以通过压力、助溶剂的速率和温度控制溶剂的溶解度[12].科研人员往往使用Box-Behnken设计法(BBD)优化和确定变量的影响并拟合超临界二氧化碳萃取工艺的实验数据[13].BBD法是一种不包含嵌入因子或部分因子设计的响应曲面设计类型,由于其设计点较少,往往比具有相同数量因子的中心复合设计的运行成本低,也较适合应用于科研工作[14].由于总实验次数会随着因素的影响而增加进而导致成本増长,BBD设计中析因设计是控制实验量的关键所在.通常,助溶剂的压力、温度和体积分数是萃取过程的关键变量[15].本文基于BBD设计法,以助溶剂的压力、温度和体积分数为实验因素优化效果参数,以获得高提取率和高抗氧化活性.为农林废弃物深加工工业超临界二氧化碳提取花生皮活性物工艺的应用提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 实验材料

花生皮来自上海市某花生酱生产企业.对于预处理过程,将花生皮在60 ℃的烤箱中干燥4 h,然后研磨成平均粒径为425 μm的粉末,并放入冰箱-20 ℃保存直至使用.液态CO2(纯度为99%)和食品级乙醇(99.86%)均购自上海沪试试剂有限公司.

1.2 仪器设备

1.2.1超临界二氧化碳和助溶剂乙醇萃取 本实验使用一套超临界二氧化碳和助溶剂乙醇萃取装置.每次提取30 min,提取时间持续3 h,收集并记录提取物.通过HPLC泵(Lab Alliance,Ⅱ系列泵)将CO2的罐体释放速率保持在3 mL/min,并在达到所需温度时连续泵送98.86%的助溶剂乙醇.冷却器和背压调节器(Jasco BP 2080 Plus Automated BPR)的温度设置为6 ℃和50 ℃.准确称取5±0.005 g的花生皮放入提取容器中.其设计方案见图1.

图1 超临界二氧化碳和助溶剂乙醇萃取装置的设计方案

1.2.2索氏提取 索氏提取法是常规提取方法.由于抽空过程和提取过程中的溶剂量少，索氏提取法具有很高的提取率.本文使用的溶剂是乙醇、正己烷、水,花生皮平均粒径为425 μm,萃取时间为6 h,比较超临界二氧化碳与索氏提取的抗氧化活性.

1.3 测定抗氧化活性

花生皮提取物的抗氧化活性的DPPH测定方法如文献[13]所述.将花生皮提取物0.5 μg与0.165 mmol乙醇混合.此外,在室温下孵育30 min.使用分光光度计UV-Vis(Webler)在516 nm处测量吸光度值,并将其转换为抗氧化活性R2(%)，度量公式为

R2=(Aa-Ab)/Aa× 100%,

(1)

其中：Aa是DPPH溶液的吸光度;Ab是DPPH溶液和萃取液之间混合物的光密度.

1.4 BBD实验设计

本研究的3个参数分别为压力(X1)、温度(X2)、助溶剂乙醇的体积分数(X3),以获得花生皮的最佳提取率R1和抗氧化活性百分比R2,用Box Behnken Design设计实验步骤(表1).

表1 实验设计的因素和水平

在这项研究中,二次模型用于拟合实验数据:

(2)

式中:Y是预测的响应;B0是常数;Bi,Bij是效应的相互作用;Xi,Xj是因子的编码值.此外,采用方差分析(ANOVA)分析了实验域内变量的响应面.

2 结果与讨论

2.1 实验结果

压力、温度和助溶剂的体积分数是影响花生皮提取物提取率和抗氧化活性的3个主要变量.为了优化提取工艺,通过二阶多项式拟合3个变量统计模型.需要进行初步研究以确定优化的固定变量.通过方差分析(ANOVA)获得了处理变量、交互作用和系数对响应变量的二次效应.用Design Expert V12软件Box-Bhenken设计进行实验设计(表2).

表2 Box-Bhenken的实验设计

由表2可知,最高提取率为16.5%，最大抗氧化活性为94.5%.提取率多项式二次模型方差分析、抗氧化活性二次多项式模型方差分析及超临界二氧化碳和助溶剂乙醇萃取的ANOVA分析见表3～5.

表3 提取率多项式二次模型方差分析表

表4 抗氧化活性二次多项式模型方差分析表

表5 超临界二氧化碳和助溶剂乙醇萃取的ANOVA

由表2可知,在压力10 MPa、温度70℃、助溶剂体积分数5%的条件下的抗氧化活性最高,为94.5%,而在压力30 MPa、温度70℃、助溶剂体积分数5%的条件下获得最高提取率为16.5%.在此基础上,选择二阶多项式方程,成功地优化了花生皮活性物的提取率和抗氧化活性.分析表明,两个模型均具有统计学意义(p<0.05).

2.2 影响提取率的参数

由于确定系数(R2)为0.853,模型的p值为0.027 8,因此二阶多项式模型(3)已成功拟合了提取率的实验数据:

Y=15.00+1.94X1+0.37X2+2.37X3-

0.90X1X2+0.60X1X3+0.73X2X3-

(3)

从表3可知,对于响应提取物,基于系数值高于其他变量,助溶剂乙醇的压力和流量是影响提取过程的最大变量.

图2显示了在恒定的最低和最高温度(X2)下,提取率随压力(X1)的增加而增加.这是因为从溶质中提取的CO2的溶解度和密度增加,很容易从溶质中提取出来.萃取过程中压力的增加会增大二氧化碳的密度,这可能会影响从溶质中萃取出来的二氧化碳的扩散性.这与提取蓖麻油类似,压力的增加会提高提取率.

图2 压力和温度对提取率影响的3D响应

最低压力条件下温度升高有利于花生皮活性物质的提取,但由于整体二次模型系数对温度的影响很小,并且温度p值高于0.05(0.5234>0.05).由图3和表3可知,助溶剂体积分数是影响花生皮活性物质提取的主要变量.乙醇作为助溶剂是一种极性溶剂,而花生皮提取物的成分为儿茶素、表儿茶素、原花青素和花青素等极性化合物,因此很容易从花生皮中提取极性化合物.压力30 MPa、温度66.5 ℃和助溶剂体积分数7.36%是获得最大提取率(17.1%)的条件.由于响应收率提取的最佳提取的确定系数(R2)大于0.8,因此具有重要意义.此外,模型在方差分析上的p值小于0.05.二次模型已成功提供了可调范围内的最佳压力、温度和助溶剂乙醇流量.

图3 温度和助溶剂速率对提取物得率的影响的3D响应

2.3 影响抗氧化活性的参数

抗氧化活性的回归模型系数与提取率模型相似.二阶多项式模型已成功拟合了提取率的实验数据(表4),其二项式模型为

Y=93.62-1.37X1+5.44X2-0.138X3-

3.13X1X2-5.96X1X3+1.35X2X3-

(4)

随后对数据进行响应面分析,温度、压力、助溶剂体积分数对抗氧化活性的影响的3D响应见图4～5.由图4可知温度对萃取过程的活性影响最大,因为温度具有较大的系数值,且在最低和最高温度(X2)下助溶剂的体积分数X3提高表明了在范围变量中间的最佳峰条件.加入乙醇作为助溶剂后,助溶剂体积分数的增加将使溶剂变成无极性溶剂,且花生皮提取物中的大多数生物活性化合物都是极性化合物,会自动增强抗氧化活性.

图4 温度和助溶剂乙醇速率对抗氧化活性影响的3D响应

从图5可以看出,在温度变化影响下,3D响应模型已经优化拟合并得到了最佳反应温度.在最高温度条件下,温度会降解提取物中的生物活性化合物.但在最低温度条件下,溶液蒸汽的作用并不占主导地位,难以从溶剂中提取溶质及其生物活性化合物.在该萃取过程中,压力并非萃取物抗氧化性的主要影响因素,压力的增加不会降解生物活性化合物.此外,温度的升高会提高抗氧化剂的活性,因此蒸气溶液的作用在这项研究中得到了体现.温度升高,从溶液中成功提取出了更多的生物活性物.综上所述,压力26.8 MPa、温度61 ℃和助溶剂乙醇体积分数5.38%是获得DPPH最大提取率(96.4%)的条件.

图5 温度和压力对抗氧化活性影响的3D响应

2.4 超临界二氧化碳及助溶剂乙醇与索氏萃取的抗氧化活性比较

与用乙醇、水和正己烷3种溶剂进行的索氏萃取相比,用助溶剂乙醇萃取超临界二氧化碳具有最高的抗氧化活性,结果见图6.

图6 各种溶剂在超临界CO2和索氏萃取抗氧化活性比较

由于提取过程的温度,索氏提取物的抗氧化活性低于超临界流体提取物的抗氧化活性.索氏提取法利用高温提取生物活性化合物并降解其中的溶质.以正己烷为溶剂的提取物的抗氧化性是最低的,表明花生皮中的大多数化合物都是极性化合物,因为正己烷是非极性的,因此难以从花生皮中提取极性化合物,如儿茶素、原花青素、花青素和表儿茶素.

2.5 工艺优化及验证

为优化花生皮活性物提取工艺,在一个最佳工艺中获得较高的DPPH提取率和最佳抗氧化活性,同时兼顾材料与能耗等因素,用Design Expert V12预测对所得的花生皮活性物的最佳提取工艺进行模拟计算，得到花生皮活性物的最佳提取工艺为压力18.67 MPa、温度69.9 ℃和助溶剂乙醇体积分数3.32%.对该工艺使用1.2节的方法进行验证,按照花生皮活性物的最佳提取工艺进行实验.由实验结果可知,DPPH提取率为16.48%,提取物最佳抗氧化活性为94.51%,均优于实验设计,说明使用Box-Behnken设计的花生皮活性物超临界CO2提取工艺优化符合预期且切实可行.

3 结论

选择二次多项式作为二次模型,以优化具有助溶剂的超临界二氧化碳萃取的响应模型的p值可优化花生皮活性物的最佳DPPH提取率和抗氧化活性(p<0.05).花生皮活性物DPPH的最佳提取率17.1%和抗氧化活性96.4%分别在压力30 MPa、温度66.5 ℃和助溶剂乙醇体积分数7.36%及压力26.8 MPa、温度61 ℃和助溶剂乙醇体积分数5.38%的条件下达到.兼顾DPPH提取率与抗氧化活性等因素,设定提取工艺参数为压力18.67 MPa、温度69.9 ℃和助溶剂乙醇体积分数3.32%.经实际验证DPPH提取率为16.48%,提取物最佳抗氧化活性为94.51%.

与索氏萃取相比,由于萃取过程的温度高,超临界二氧化碳和助溶剂乙醇的抗氧化活性更高.高温会降解提取物中的生物活性化合物并降低其抗氧化活性.