李占鸿，谢佳芮，杨振兴，寇美玲，李华春，高 翔，胡忠燕，李卓然，廖德芳，杨 恒

(1 云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224； 2 景洪市动物疫病预防控制中心，云南 景洪 666100)

芒市病毒 (Mangshi virus, MSV)为一种新发现的虫媒病毒，隶属呼肠孤病毒科Reoviridae东南亚十二节段RNA病毒属Seadornavirus，病毒于2013年从云南省芒市采集的三带喙库蚊Culex tritaeniorhynchus中首次分离并因而得名[1]，随后在我国广东省汕头市濠江区采集的三带喙库蚊中再次分离到MSV[2]，目前对该病毒在动物健康和公共卫生的危害尚不清楚。近年，寨卡病毒[3]、登革热病毒[4]、非洲猪瘟病毒[5]、非洲马瘟病毒[6]等新发和再发虫媒病毒给我国公共卫生安全和畜牧业生产带来了严重威胁。掌握我国新发虫媒病毒的分布、遗传特征、感染宿主动物范围与致病性等方面的信息，对我国虫媒病毒病的防控具有重要的意义。

东南亚十二节段RNA病毒属为2005年第8次国际病毒分类委员会(ICTV)新定义的1个病毒属[7]，目前该属包括了MSV、版纳病毒(Banna virus, BAV)、卡皮罗病毒 (Kadipiro virus, KDV)与辽宁病毒 (Liaoning virus, LNV) 4 种病毒。1987年从我国云南省西双版纳市出现发热与病毒性脑炎症状的患者中分离到BAV[8]，于1981年从印度尼西亚爪哇采集的褐首库蚊Culex fuscocephalus中分离到KDV[9]，1990年在我国辽宁省采集的背斑伊蚊Aedes dorsalis中分离到LNV[10]。从牛、猪以及出现发热症状的人体上分离到BAV[11-12]，提示东南亚十二节段RNA病毒可感染人和多种动物，对动物养殖和公共卫生安全具有潜在威胁。

MSV病毒粒子为二十面体球形颗粒，直径为60～70 nm，表面具有蛋白纤突[2]。病毒的基因组大小为 20622 bp，由 12 个基因节段 (Seg-1 至 Seg-12)的双链 RNA(Double strand RNA, dsRNA)组成，各基因节段大小在 788 bp(Seg-12)至 3740 bp(Seg-1)之间，可编码VP12(199个氨基酸残基)至VP1(1215个氨基酸残基)等12种蛋白[1]。目前对东南亚十二节段RNA病毒各基因节段编码蛋白的功能尚不完全明确，初步认为Seg-4与Seg-9编码的VP4与VP9蛋白构成病毒的外层衣壳，Seg-2与Seg-7编码的VP2与VP7蛋白构成病毒的内层衣壳，Seg-1与Seg-3编码的VP1蛋白(RNA依赖RNA聚合酶)与VP3蛋白(鸟苷酸转移酶)位于病毒的核心，Seg-6、Seg-8与Seg-12编码3种非结构蛋白，分别为VP6(三磷酸核苷酶)、VP8(蛋白激酶)与VP12(双链RNA结合蛋白)[13-15]。

2019年，我们从云南省景洪市哨兵牛的血液中分离到了1株病毒(毒株号：V301/YNJH/2019)，基因组琼脂糖凝胶电泳与电镜观察显示，病毒具有东南亚十二节段RNA病毒属的典型特征，通过测定Seg-2、Seg-4、Seg-7与Seg-9全长序列确认该病毒为MSV。对自然感染MSV哨兵牛血液中的病毒核酸与中和抗体回溯分析显示，病毒在动物上呈“一过性感染”的特征，感染动物未出现明显的临床症状。研究结果丰富了对我国流行的东南亚十二节段RNA病毒的认知，为开展MSV的流行病学、致病性与诊断试剂的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与毒株

白纹伊蚊细胞(C6/36细胞)由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室保存，细胞于27 ℃条件下以含10%(φ)胎牛血清的DMEM培养，蓝舌病病毒 (Bluetongue virus, BTV)血清 4 型毒株(BTV-4/YTS4)[16]、动物流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus, EHDV)血清10型毒株 (EHDV-10/V277)[17]、BAV毒株(BAV/SC043)均由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室分离保存。

1.2 主要试剂

总RNA提取试剂RNAiso-Plus、核糖核酸酶S1、病毒DNA/RNA提取试剂盒、一步法RTPCR试剂盒、实时荧光定量qRT-PCR试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒、高分辨率琼脂糖等购自大连宝生物公司；Q5 超保真DNA聚合酶购自美国NEB公司；RNA纯化试剂盒购自美国OMEGA公司；PLB平末端克隆载体与大肠埃希菌DH5α感受态细胞购自北京天根公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中公布的东南亚十二节段RNA病毒的序列，设计4对引物分别用于MSV、BAV、KDV与LNV基因节段Seg-12的一步法RTPCR扩增；根据MSV/DH13M041毒株的Seg-2、Seg-4、Seg-7与 Seg-9序列 (GenBank号：KR349188、KR349190、KR349194 与 KR349195)设计4对引物用于上述4个基因节段全长序列的扩增；根据MSV/DH13M041毒株的Seg-12序列(GenBank号：KR349197)设计PCR扩增引物与TaqMan探针，用于哨兵动物血液样本中MSV病毒核酸的qRT-PCR检测，探针的5′端标记 FAM(6−羟基荧光素)荧光基团，3′端标记黑洞淬灭基团(Black hole quencher, BHQ1)。引物序列如表 1 所示，由上海捷瑞公司合成。

1.4 哨兵动物的设立与血液样本的采集

2019年5月，在云南省景洪市勐罕镇(E100°59′53″，N21°54′58″，海拔 550 m)设置 3 头年龄为1周岁，BTV与EHDV抗体检测为阴性的云南黄牛作为虫媒病毒监测的哨兵动物。哨兵动物不使用任何疫苗与驱虫药物，采用放牧方式进行单独饲养。5—10月，每周由当地职业兽医从哨兵牛上分别采集全血、肝素钠抗凝血与EDTA抗凝血共3种血液样品。将采集的血液样品保存于4 ℃冰盒，送至云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室进行虫媒病毒的检测与分离。

1.5 病毒分离

取500 μL采集自哨兵动物的肝素钠抗凝血，离心收集红细胞 (Red blood cell, RBC)，以 PBS 缓冲液洗涤RBC 1次。加入灭菌水裂解RBC。取RBC裂解液接种生长成单层的C6/36细胞并盲传3～5代。当接种细胞出现规律的细胞病变(Cytopathic effect, CPE)，离心收集细胞上清，−80 ℃ 条件下冻存，留待进一步的鉴定。

1.6 病毒基因组dsRNA提取与琼脂糖凝胶电泳

取病毒液接种细胞，待细胞出现完全CPE，离心收集细胞沉淀。以RNA提取试剂RNAiso-Plus提取细胞总RNA，参照文献报道的方法[18]以核糖核酸酶S1降解宿主细胞单链RNA(Singlestrand RNA, ssRNA)，使用 RNA 纯化试剂盒进行纯化。取纯化后的病毒核酸，以20 g/L的高分辨率琼脂糖凝胶电泳，观察病毒核酸在琼脂糖凝胶上的电泳带型。

1.7 病毒的电镜观察

将冻融处理后的病毒液以 8 000 r·min−1离心10 min，除去细胞碎片。使用 SW40转头，在Beckman 超速离心机上以 40 000 r·min−1离心 3 h。将离心后的沉淀以适量TNE Buffer重悬，置于4 ℃条件下过夜，12 000 r·min−1离心 5 min。取超离后的病毒液滴于铜网上，以20 g/L的磷钨酸溶液(pH6.8)进行负染，在透射电镜(日立HT7800, 日本)下观察病毒粒子的形态。

1.8 RT-PCR扩增与克隆测序

取纯化后的病毒dsRNA，94 ℃变性处理3 min，立即冰浴，进行dsRNA的解链。取变性核酸为模板，使用表1中针对MSV、BAV、KDV与LNV的Seg-12的鉴定引物进行分离病毒的一步法RT-PCR扩增鉴定。

表 1 本研究中使用的引物与探针序列Table 1 Primers and probe used in this study

采用全长 cDNA扩增技术 (Full length cDNA application technique, FLAC)[19]，获取病毒基因组全长cDNA。以合成的cDNA为模板，使用表1中的扩增引物，通过Q5高保真DNA聚合酶扩增分离毒株的Seg-2、Seg-4、Seg-7与Seg-9全长序列。电泳胶回收各个基因节段的PCR产物，将回收的DNA片段克隆入PLB平末端克隆载体中，转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行PCR鉴定与测序。

1.9 序列分析与系统发生树的构建

使用NCBI的ORF分析软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)对获取的 Seg-2、Seg-4、Seg-7与Seg-9基因节段编码氨基酸序列进行翻译。从GenBank上下载东南亚十二节段RNA病毒的序列，使用Mafft-win序列比对软件[20]与本研究中获取的病毒序列进行比对，使用BioEdit计算核酸与氨基序列相似度，使用MAGA X[21]以邻接法(Neighbor-joining, NJ)构建系统发生树，使用遗传距离法 (Genetic distance method)计算P-distance，自举检验值 (Bootstrap)取 1 000。

1.10 病毒在动物上的感染特性分析

取哨兵牛上采集的EDTA抗凝血50 μL，使用磁珠法病毒RNA抽提试剂盒提取核酸，采用表1中MSV的qRT-PCR引物，分析感染动物血液中病毒核酸的动态变化。qRT-PCR反应条件为：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共 40 个循环，待检血液中病毒的核酸含量以qRT-PCR反应产生荧光信号的循环阈值数 (Cycle threshold , Ct)表示。

将病毒液10倍梯度稀释后接种C6/36细胞，以Karber法[22]测定分离病毒的半数组织培养感染剂量 (Median tissue culture infective dose，TCID50)；将感染动物的血清56 ℃灭活30 min，倍比稀释备用。将病毒液稀释为每50 μL含100个TCID50，取50 μL 稀释的病毒液与倍比稀释的血清作用 2 h，在96孔板上采用“固定病毒−稀释血清”的方法测定稀释血清对病毒的中和作用，通过Karber法[22]计算血清中和抗体效价，分析感染动物血清中和抗体的动态变化。

2 结果与分析

2.1 病毒的分离

2019年5—10月，3号哨兵牛共计采集肝素钠血液、EDTA抗凝血和血清各24份。将采集的肝素钠血液样本接种细胞进行病毒的盲传分离。8月7日采集的血液样本在C6/36细胞上连续盲传5代后，细胞出现规律的CPE，表现为接种后的细胞在96 h 出现聚集，120 h 后出现皱缩、脱落与裂解(图1)。离心收集病变C6/36的细胞上清，将其命名为V301/YNJH/2019，进行下一步的鉴定。

图 1 V301/YNJH/2019毒株接种C6/36细胞后引起的细胞病变Fig. 1 Cytopathic effect of C6/36 cells after inoculated with V301/YNJH/2019 strain

2.2 分离病毒的基因组电泳与电镜观察结果

提取并纯化V301/YNJH/2019、BTV-4/YTS4、EHDV-10/V277与BAV/SC043毒株的核酸，进行高分辨率琼脂糖凝胶电泳。结果显示，V301/YNJH/2019毒株的基因组为dsRNA，其凝胶电泳带型特征与作为对照的东南亚十二节段RNA病毒BAV/SC043毒株接近，而与环状病毒属病毒BTV-4/YTS4和EHDV-10/V277毒株相差较大(图2A)。

通过超速离心进行病毒的富集，电镜下观察可见V301/YNJH/2019的病毒粒子直径约60～70 nm，呈“指环状”，病毒表面可见明显的花瓣状的突起，与文献报道[2]的东南亚十二节段RNA病毒的病毒粒子特征接近(图2B)。以上结果提示V301/YNJH/2019毒株可能为东南亚十二节段RNA病毒的1个成员。

图 2 V301/YNJH/2019毒株的基因组琼脂糖凝胶电泳(A)与电镜观察(B)Fig. 2 Agarose gel electrophoresis (A) and electron microscopic observation (B) of genomic dsRNA from V301/YNJH/2019 strain

2.3 病毒的RT-PCR鉴定

使用表 1中针对 M S V、B A V、K D V与LNVSeg-12的特异性引物，对V301/YNJH/2019毒株的核酸进行一步法RT-PCR扩增鉴定。结果显示仅针对MSV的引物可扩增出符合预期大小约600 bp的DNA条带(图略)。BLAST比对分析显示，扩增序列与MSV毒株(MSV/DH13M041)的Seg-12/VP12核酸与氨基酸序列相似度最高，分别为98.4%与99.0%，初步表明V301/YNJH/2019为MSV的1个成员。

2.4 分离病毒的基因节段扩增与测序

为明确V301/YNJH/2019的分类地位以及与其他东南亚十二节段RNA病毒之间的进化关系，对病毒的Seg-2、Seg-4、Seg-7与Seg-9共4个基因节段全长序列进行RT-PCR扩增，结果显示可扩增出大小约为1～3 kb的DNA条带(图3)。将扩增的DNA片段进行克隆测序，显示获取病毒序列长度在1 076～3 055 bp之间 (表 2)。

图 3 V301/YNJH/2019毒株4个基因节段全长序列的RTPCR扩增Fig. 3 RT-PCR amplification products for four full length segments of V301/YNJH/2019 strain

2.5 序列分析与系统发生树构建结果

将V301/YNJH/2019毒株的测序结果进行BLAST比对与编码氨基酸预测分析，结果显示我们成功获取了V301/YNJH/2019毒株的Seg-2、Seg-4、Seg-7与Seg-9基因节段全长序列，4个基因节段分别编码956、628、314与283个氨基酸残基的VP2、VP4、VP7与VP9蛋白，VP4与VP7编码MSV的外层衣壳蛋白，而VP2与VP9编码该病毒的内层衣壳蛋白[1]。获取的各基因节段的5′UTR长度均短于 3′UTR，5′UTR 长度在 23 bp(Seg-4)～88 bp(Seg-2)之间，3′UTR 的长度在 99 bp(Seg-7)～201 bp(Seg-3)之间(表2)，与其他东南亚十二节段RNA病毒上观察到的情况一致[8-11]。各基因节段5′UTR与3′UTR末端高度保守的序列特征为：5′-GUAAA GA……GAC-3′。

表 2 V301/YNJH/2019毒株4个基因节段以及编码蛋白的序列特征Table 2 Characteristics of four gene segments and their encoded proteins of V301/YNJH/2019 strain

与其他东南亚十二节段RNA病毒的序列比对结果显示，V301/YNJH/2019毒株与MSV/DH13M041毒株具有最近的亲缘关系，Seg-2、Seg-4、Seg-7与Seg-9的核酸序列相似度在97.4%( Seg-9)～98.5%(Seg-2)之间，对应的氨基酸序列相似度在96.4%(VP9)～98.4%(VP2)之间；与同属的BAV、KDV和LNV的序列相似度均远低于MSV(表2)。在构建的系统发生树上，V301/YNJH/2019毒株的 Seg-2、Seg-4、Seg-7与 Seg-9分别与MSV/DH13M041毒株对应的基因节段聚为一簇(图4)，独立于BAV、KDV与LNV毒株。以上结果确证了我们从哨兵牛中分离出的病毒为MSV，提示MSV可能通过蚊科动物在动物之间进行传播；MSV与BAV在系统发生树上聚为一簇，提示2种病毒在进化上有着更近的亲缘关系。

2.6 感染动物血液中病毒核酸的回溯分析结果

提取整个检测期3号牛采集的24份EDTA抗凝血的核酸，进行V301/YNJH/2019病毒核酸的qRT-PCR检测。在第11周采集的血液样本中，可检测到V301/YNJH/2019的病毒核酸(Ct=37.3)，表明病毒在该时间段内感染了哨兵牛。感染动物血液中V301/YNJH/2019病毒核酸含量在监测期的第13周处于最高水平(Ct=32.1)，在该周采集血液中，我们分离出了V301/YNJH/2019毒株。随后病毒核酸含量逐步降低，监测期的第18周血液中未检测到病毒核酸(图5)。以上结果提示MSV感染牛后，病毒血症高峰期较短，仅维持1周时间，这为我们从感染MSV的动物上分离病毒提供了可参考的线索。

图 4 基于邻接法构建V301/YNJH/2019毒株4个基因节段的系统发生树Fig. 4 Phylogenetic trees of four segments of V301/YNJH/2019 using Neighbor-joining method

图 5 自然感染V301/YNJH/2019毒株哨兵牛血液中病毒核酸与中和抗体监测Fig. 5 Monitoring of viral nucleic acid and neutralization antibodies in the blood samples collected from sentinel cattle naturally infected with V301/YNJH/2019 strain

2.7 感染动物血清中和抗体的回溯分析结果

5—10月，3号哨兵牛共计采集血清24份。V301/YNJH/2019在C6/36细胞上的TCID50为5.43×106/mL。通过血清中和试验测定感染牛血液中病毒特异性中和抗体产生情况。结果显示在检测到病毒核酸后的第2周，感染动物的血清中已可检测到特异性的中和抗体，抗体滴度为1∶14。在病毒感染后的第5周，特异性中和抗体水平到达高峰，抗体滴度为1∶226；抗体滴度在最高点维持2周后，逐渐下降并维持在一个稳定水平，在采血期结束，中和抗体水平仍维持在1∶57(图5)。

3 讨论与结论

东南亚十二节段RNA病毒在我国的南方与北方地区均有分布。BAV广泛分布于我国的北京市、辽宁省、内蒙古自治区、山东省、甘肃省、山西省、江苏省、云南省与福建省[8, 11]；KDV于2009年在我国云南省采集的三带喙库蚊、中华按蚊Anopheles sinensis和骚扰阿蚊Armigeres subalbatus中首次分离[23]，在我国山东采集的白纹伊蚊Aedes albopictus中也分离出该病毒[24]；LNV除在我国辽宁省首次分离外，在我国新疆维吾尔族自治区、青海省也有从蚊子中病毒分离的报道[25]；MSV最近在我国的云南省与广东省三带喙库蚊中分离发现[1-2]，MSV的感染宿主动物的范围、感染特征、是否具有遗传多样性等问题仍有待研究。本研究首次报道了MSV在哨兵牛中的分离、鉴定与遗传进化特征，在易感动物层面对病毒的感染特性进行了分析。以上研究结果丰富了我们对MSV的认知，为开展该病毒感染宿主范围、致病性风险分析与诊断技术的研究提供了基础。

通过对分离毒株的电镜与病毒基因组琼脂糖凝胶电泳观察，我们初步猜测分离病毒可能为东南亚十二节段RNA病毒，采用东南亚十二节段RNA病毒特异性RT-PCR扩增，基本确认V301/YNJH/2019毒株为MSV的1个成员。进一步需明确该毒株与其他东南亚十二节段RNA病毒之间的进化关系以及病毒的血清型(或基因型)等关键信息。东南亚十二节段RNA病毒的外层衣壳蛋白，具有高度变异的特性，可诱导特异性抗体的产生[1, 9, 24-25]；内层衣壳蛋白在病毒粒子的组装中发挥重要作用，其氨基酸序列在同种病毒中具有高度保守的特性，可作为鉴定病毒种属间进化关系的主要依据[1, 9, 24-25]。因此我们考虑对分离毒株的Seg-2与Seg-7(编码MSV的内层衣壳蛋白VP2与VP7)，Seg-4与Seg-9(编码MSV的外层衣壳蛋白VP4与VP9)进行全长测序，从而明确V301/YNJH/2019在病毒分类与进化关系上的位置。更为重要的是，我们希望知道我国流行的MSV是否存在其他的血清型或基因型，这是掌握病毒多样性最为关键的信息之一。

序列分析显示，V301/YNJH/2019毒株的Seg-2/VP2和Seg-7/VP7序列与云南省芒市分离的MSV/DH13M04毒株高度相似(核酸和氨基酸序列相似度分别高于97.7%和98.9%)；在Seg-2与Seg-7构建的系统发生树上，V301/YNJH/2019毒株与DH13M041毒株构成了独立于其他东南亚十二节段RNA病毒的进化分支，表明云南省芒市分离的DH13M041与景洪分离的V301/YNJH/2019毒株代表着MSV的2个不同毒株，二者具有最近共有祖先 (Most recent ancestors，MRA)。V301/YNJH/2019毒株的Seg-4/VP4和Seg-9/VP9与DH13M041毒株对应序列之间也高度相似，在系统发生树上聚为一簇，以上结果提示V301/YNJH/2019与DH13M041均属于MSV的同一种血清型。环状病毒属Obivirus的蓝舌病病毒(BTV)、动物流行性出血病病毒(EHDV)和非洲马瘟病毒(ASHV)均具有众多的血清型[6, 26-28]。东南亚十二节段RNA病毒属与环状病毒属病毒有着最近的亲缘关系，但为什么目前分离的BAV、KDV、LNV和MSV毒株中均只发现一种血清型？通过对东南亚十二节段RNA病毒属与环状病毒属病毒在“病毒−媒介−感染动物”上的比较，将有助于我们理解虫媒病毒血清型多样性产生的原因。

目前仅在三带喙库蚊中分离到MSV，该病毒感染动物宿主范围与感染特性尚不清楚。在哨兵牛上分离出MSV毒株，为我们通过回溯追踪分析病毒在动物上的感染特性提供了可能性。对感染MSV哨兵牛血液中病毒核酸的qRT-PCR监测结果显示，MSV在感染动物后的第3周出现病毒血症高峰期，我们也在该时间点从血液样本中成功分离到病毒，随后病毒核酸含量逐步降低，5周后血液中未检测到病毒核酸，我们试图使用其他核酸检测为阳性的血液接种细胞再次分离MSV，但病毒分离均不成功，我们认为很可能随着感染动物体内中和抗体的产生，病毒虽然在血液中存在，但由于中和抗体与病毒粒子的结合，导致病毒的感染性大幅下降，使病毒的分离困难。对MSV中和抗体的监测结果显示，哨兵牛在病毒感染第3周已经产生中和抗体，且在随后的2周达到高峰，至监测期结束，血液中的中和抗体效价仍维持在1∶57的水平，表明MSV感染动物后可很快激发动物的免疫应答，产生病毒特异性中和抗体，可保护动物在较长时间免受MSV的再次感染。

目前在GenBank中仅有1个MSV毒株的全基因组序列(DH13M041毒株)，在进一步的工作中，我们将完成V301/YNJH/2019毒株的全基因组测序，完善MSV的qRT-PCR与RT-PCR检测方法。我们对本研究中另外2头哨兵牛血液与血清样本进行了MSV核酸与抗体的检测，但检测结果均为阴性，对MSV在云南省的牛和其他家畜中的流行情况以及其他媒介昆虫是否携带MSV尚不明确，进一步开展家畜与媒介中MSV的流行病学调查研究，分析病毒感染动物范围与潜在致病性十分必要，这些研究工作将获取对MSV更为全面的认知。