陈丽旋

（广东省江门市人民医院 病理科，广东 江门 529000）

0 引言

冰冻切片是临床快速病理诊断的一种技术，因其具有快速、准确等优点[1]，使其在术前病理诊断中应用广泛。其目的在于了解病变组织性质决定手术方案，了解恶性肿瘤的扩散情况确定手术范围，确定肿瘤部位的手术切缘有无肿瘤组织残留，以及确认切除的组织[2]。但由于我国医疗技术的不断发展，使外科手术方式越来越多，从而也相应的增加了组织标本类型。在以上背景下，对100例冰冻切片进行了相关研究，为后期冰冻切片提供一定的参考价值，用以提高切片优良率。

1 资料与方法

1.1 一般资料。从广东省江门市人民医院2019年8～10月的冰冻切片中，抽取100例作为本次研究的对象。其中包括甲状腺、乳腺、肺、卵巢等。所有组织均为术中切除并立即送检的新鲜组织。

1.2 方法。

（1）取材：将未经任何处理（无固定，无液体浸泡）的新鲜组织，且组织块大小厚薄适宜未受挤压，所选取组织尽量保持组织的原有形态，并切除组织内异物及不需要部分。

（2）组织包埋：①与诊断医师取材时约定好包埋方向，如囊壁组织应该竖着埋，对于有包膜组织可能需要粗切更多令包膜完整；②组织过小时，冷冻头需要填补更多OTC包埋剂，并小心进刀；③使用OTC包埋剂应该适量：挤胶太少不好固定组织，容易造成跳片，使切片厚薄不均且不完整；挤胶太多则会造成浪费且延长冷冻时间；④肿瘤过少的标本在包埋的时候做好记号，避免过度切片造成漏诊。

（3）切片：①将冻好的组织块固定在样本托上，切片时，温度以-15℃至-20℃为宜，根据不同的组织特性可以进行调节。如果温度太低，片子容易卷曲和破碎；如果温度太高，片子就会皱成一堆；②调整好刀片和组织块的方向，使其垂直。刀片的锋利性很重要，当片子质量下降时最好立即更换刀片；③先切掉表面的包埋剂，直至待取组织露出后调整好片子厚度开始正式切片。切片厚度根据不同的组织和实验目的而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍微厚切；④切出完整的片子后，左手用毛笔轻轻地从上向下展平组织，右手用常温玻璃载玻片平稳地轻压组织，使其平整地吸附到载玻片上，并迅速放入酒精福尔马林冰醋酸（AAF）固定液中。

（4）AAF固定液固定后（10～30 s），流水冲洗，进入常规HE染色，脱水、透明后，中性树胶封片，贴上标签。

（5）不同组织冰冻切片：①微小组织：可将其体积增大，便于切片。先放少量OCT包埋剂在冷冻头上，用以垫高组织，待其凝固后修平。之后取微小组织置于垫高的OTC包埋剂中，将待切面朝上。然后再放入适量OCT包埋剂置于冰冻切片机内继续冷冻。由于微小组织体积较小，所以应提高温度，控制在-18℃至-20℃最佳，以免因温度过低使微小组织过硬变脆，继而不利于切片，冷冻1 min后切片；②囊壁样组织：由于此类组织相对于较薄，在进行切片时易出现折叠、卷曲现象。所以在取材时应先将组织切成适宜大小（长10～15 mm或15～20 mm，宽3 mm），并卷曲成团。之后将包埋剂放在冷冻头上，采用镊子夹紧组织置于包埋剂中，轻压组织使其完全浸没在包埋剂中。同时保持竖埋状态，避免产生气泡。温度控制在-15℃至-20℃为宜，冷冻2 min后修整组织块，切出5～6μm切片，并直接贴附在载玻片上，注意动作要轻快；③甲状腺组织：冷冻温度以-15℃至-18℃为宜，温度过高时，甲状腺组织变粘，易产生皱褶：温度过低会使组织变脆，产生空洞裂隙，此时，我们可以利用手掌温度使组织回温，以便切出平整完整的切片；④富含脂肪类组织：该类组织呈黏液样或鱼肉样，内含脂肪空泡，质软，如乳腺组织、带有较多脂肪的淋巴结等。所以温度必须更低，冷冻时间更久。温度控制在25℃至-30℃最佳，冷冻时间3 min，当OTC包埋剂凝固组织变硬后切片，切片厚度8～10μm甚至更厚，切片时速度一定要快，不然容易发生切片粘连，且染色时冲洗不宜过急和需缩短分化时间，以免出现脱片；⑤肺组织：属于疏松结缔组织，温度过高，切片过薄均容易造成组织切片空洞、筛状，故我们将温度控制稍低于日常使用，以-22℃最佳，厚度调至大于5 μm（以7 μm为宜），这样使切片更加完整；⑥脑组织。脑组织质软，水份较多，冰冻切片易形成冰晶。一般选用不含水份的OCT包埋剂，温度控制在18℃～20℃为宜，冷冻时间宜短，控制在2 min内，切片时动作轻巧，黏贴切片时不可重压，切片后用冷风吹干，固定时间不宜过长，这样既可防止切片皱褶、冰晶、胞核固缩、核聚集、结构松散等人为假象的产生；⑦含脂肪较多的组织。这类组织包括乳腺、脂肪组织来源的肿瘤等，质地较软，内含脂肪空泡，冷冻温度必需低，时间也要长，一般温度为28℃～30℃，时间8 min，组织稍硬时方宜切片，并可适宜增加切片厚度6～8 μm，切片时进刀要快，染色时不宜加热，否则宜造成切片粘连、脱片等；⑧含纤维、肌肉成份较多的组织。这类组织的代表是纤维瘤、平滑肌瘤等，一般组织硬、韧，取材时切成方形，切片时将组织对角线与刀片平行放置，减少组织作于刀片的阻力。冷冻温度一般在23℃～25℃，冷冻时间不能过长，一般组织冷冻至八成时切片较佳，否则一旦组织过硬，很难切片，而且厚薄不均，易脱片；⑨皮肤组织。皮肤表皮较硬，皮下结缔组织及脂肪组织较软，故皮肤组织形成软硬度差，冷冻温度和时间是不一致的。我们一般将温度控制在-23℃至-25℃，顾及到软的组织冷冻至能切片为宜。切片时应先切软的部分，即依次切真皮，表皮，这样一般都能切出完整的切片。

1.3 观察指标。对比不同切片质量及诊断效能。根据切片完整度、平整度、染色、透明、封裱等情况，将切片分为优、良、中、差4个等级[4]。

1.4 统计学分析。采用SPSS 21.0对数据处理，计数采用%表示，计量采用（±s）表示，使用χ2/t校检；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同切片切片质量对比。冰冻切片质量大多为优，优良率为96%，与石蜡切片优良率98%相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表1。

表1 不同切片切片质量对比[n(%)]

2.2 不同切片诊断效能对比。两种切片在误诊率、诊断准确率上数据差异无计学意义（P＞0.05），但冰冻切片诊断时间（0.45±0.22）h，要短于石蜡切片（36.25±12.16）h，组间数据对比差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

表2 不同切片诊断效能对比

3 讨论

优良的切片是准确诊断的前提[3]，但由于不同组织结构不同，使切片条件也存在少许差异，尤其是对于不同组织所需温度更难掌握，继而影响了冰冻切片的质量。

本研究结果显示，冰冻切片质量大多为优，优良率为96%，与石蜡切片优良率98%相比，差异无在统计学意义（P＞0.05）。两种切片在误诊率、诊断准确率上数据差异无在统计学意义（P＞0.05），但冰冻切片诊断时间（0.45±0.22）h，要短于石蜡切片（36.25±12.16）h，组间数据对比差异有在统计学意义（P＜0.05）。说明了冰冻切片的临床应用效果基本与石蜡切片相近，但冰冻切片诊断所需时间更短。高质量的冰冻切片除了取材规范、切片刀锋利外，组织的冷冻时间和冷冻程度很关键，冷冻过硬或冷冻不够都切不出优质的切片。总结应注意以下几个环节。①取材送检。送检组织不需固定，避免遇水，如本身含水分较多，应用滤纸吸干，目的在于防止切片产生空洞、冰晶；取材中尽量避免脂肪组织和坏死组织，以免制不出片子；取材组织块厚度不超过3 mm，防止冷冻时间过长造成组织干、硬、脆；②冷冻温度。应根据组织大小、形态结构和性质组成的不同调节不同的温度。温度过低，组织块硬，切片碎裂；温度过高，组织块硬度不够，切片不成形。如组织已很脆，可等几分钟或用手按压组织，将组织回暖片刻再切。所以要获得一张既薄又完整的切片，控制最佳温度很关键。我们的经验是：微小组织18℃～19℃；囊壁样组织26℃～28℃；甲状腺、淋巴结、脑18℃～20℃；乳腺、脂肪含量高的肿瘤28℃～30℃；皮肤、纤维、肌肉23℃～25℃；③包埋。选用包埋剂处理时，冷凝后将其修片再切。另外冷冻头不要预先冷冻，以免温差太大包埋剂不能与冷冻头牢固结合而脱落；④切片、固定。提前做好准备，如刀要锋利，按在刀架上，调节好角度等。切片手摇用力要均匀、柔和，摇速合适，抗卷板与刀锋间距离要合适。切片后立刻放入酒精固定，这样组织不易退变、收缩，且染色清晰；⑤染色、封片。HE染色应着色佳、清晰透明，胞质胞核分明，对比度好，为此应及时更换无水酒精及二甲苯，以免脱水不净致切片不透明，出现云雾。封片时要防止气泡及溢液，使得切片整洁。冰冻切片是将组织置于低温条件下快速冷却到一定硬度，然后再进行切片。但不同组织所需要的冷冻温度不一样，而温度过高或过低会导致组织过硬或过软[5]。一般柔软稚嫩富含水分的组织温度设置在-10℃至-25℃，以免出现温度较低使切片呈碎屑状，而对于致密富含脂肪的组织则温度设置在-25℃至-35℃，以免造成切片堆积不能形成片状。冰冻切片在30 min之内就可以得到病人病理报告。因其快捷、简便，所以常用于手术中的快速病理诊断。石蜡切片则需要将切下的病变组织经过固定、取材、脱水等一系列技术处理，所以其诊断时间相对较长。但由于冰冻切片是通过冷冻来获得硬度从而制成的切片，当组织冰冻后，可造成细胞变形，形成冰晶等人为假象影响了对组织的观察，加上检查材料有限，增加了诊断难度，且冰冻切片的片子，相对于石蜡切片，组织结构形态的保存较差，且保存时间较短[6]。不过，冰冻切片剩余的组织，相对固定较及时充分，故其抗原性保存较好，在后续的免疫组织化学染色中应用更好。

综上所述，快速冰冻切片技术的临床应用价值较高，具有“快和准”的特点。为手术进展提供科学依据，特别是对恶性肿瘤手术，手术医师可以直接根据病理结果选择手术方式及手术范围，优化手术方案，有效地避免了二次手术及损伤。但组织受冰冻后，可造成细胞变形，发生人为假象，加上检查材料有限，增加了诊断难度，存在误诊及微小病灶漏诊的可能。同时快速冰冻切片技术也是较难掌握的技术之一。因此在实际操作过程中，应严格规范操作，尽量保证切片的质量，减少漏诊、误诊概率。并对于小部分难以做出明确诊断的病例，需等待石蜡切片进行最终诊断。