樊锐锋 王若凡 杜艳秋 刘艳 黄庆阳

摘 要：  为寻找促进药用植物活性代谢产物合成的微生物，该文以黄精为研究对象，利用高通量测序技术和生态功能预测平台，测定根际土真菌、根茎和根内生真菌的ITS序列，分析其真菌多樣性和群落组成，并预测根茎内生真菌的生态功能。结果表明：（1）测序得到1 023个可操作分类单元（OTUs），根际、根茎和根真菌OTU数分别为703、128和141，三种部位真菌群落组成差异显著，根际土存在特有的真菌类群，即壶菌门。（2）根际土、根茎及根共有OTU 41个，子囊菌门占共有真菌的58.15%，丰度最大。（3）根茎内生真菌被划分6个生态功能群，包括未定义腐生菌、菌寄生真菌、动物病原菌、植物病原菌、丛枝菌根真菌和地衣共生真菌，37个undefined种类（34.91%）在FUNGuild数据库中没有参考信息。研究认为根茎中优势菌属Setophoma、新赤壳属等内生真菌可能与活性代谢产物密切相关，可为黄精药用功能菌群的发掘提供数据参考。

关键词： 黄精， 内生真菌， 根茎， 群落组成， FUNGuild

中图分类号：  Q948.12

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2021）05-0799-09

Abstract：  To find microbes promoting the biosynthesis of active metabolites in medicinal plants， with Polygonatum sibiricum as materials， the ITS region of fungi form rhizosphere， rhizome and root was sequenced by Illumina MiSeq to analyze the diversity and community composition， and FUNGuild was used to analyze the ecological function categories of endophytes fungi in rhizome. The results were as follows： （1） A total of 1 023 operational taxonomic units （OTUs） were obtained from all samples of P. sibiricum. The numbers of OTU from rhizosphere， rhizome and root fungi were 703， 128 and 141， respectively. The composition of fungal community in three samples was significantly different， and there was specific fungi Chytridiomycota in root. （2） There was 41 OTU in common of three samples， and Ascomycota accounted for the highest proportion （58.15%）. （3） In ecological functional， endophytic fungi of rhizome in P. sibiricum contained six functions groups， undefined saprotroph， mycoparasites， plant pathogen， animal pathogen， arbuscular mycorrhizal fungi， lichenized fungi， and 37 undefined species （34.91%） had no reference information in the FUNGuild database. It is suggested that the dominant endophytic fungi like Setophoma and Neocosmospora in rhizome may be important microbial communities affecting the biosynthesis of the active products， which provides data reference for the exploration of medicinal functional microorganisms in P. sibiricum.

Key words： Polygonatum sibiricum， endophytic fungi， rhizome， community composition， FUNGuild

黄精（Polygonatum sibiricum）为百合科多年生草本植物，在我国以黑龙江、辽宁、河北、内蒙古等地为主产区（李亚霖等，2019）。黄精以干燥后的根茎入药，其主要化学成分包括多糖、皂苷、生物碱、氨基酸、挥发油等（Zhou et al.， 2019）。黄精是中国传统中药材之一，也是重要的药食同源性植物，具有广阔的开发应用前景（Debnath et al.， 2013;国家药典委员会，2015）。

内生菌广泛存在于不同种类植物组织或器官内部，与寄主植物长期协同进化，并不引发宿主植物表现出外在病害症（姚领爱等，2010），主要包括真菌、细菌和放线菌。内生菌可以影响药用植物的生长和发育（Tan et al.， 2014;郭凤仙等，2017），并产生与药用植物活性成分相近的次生代谢产物，如在杜仲中合成抗氧化活性的黄酮类化合物、在刺五加中合成抗氧化的皂苷类物质等（郭顺星，2018;杨娟等，2019）。目前，有关药用植物内生真菌的研究主要集中在丹参（周丽思等，2018）、重楼（王艳等，2019）、虎杖（马云桐等，2009）、三七（Wu et al.， 2015）等根和根茎入药的药用植物。学者对黄精内生菌和活性代谢产物的研究甚少，仅见于黄精和多花黄精中三种芽孢杆属内生细菌（HJ-1、HJ-2和ZJU-3）具有抗菌活性（柏晓辉等，2018;迟惠荣等，2019;翟大才等，2019），内生真菌的研究见于黄精中镰刀菌属、链格孢属和曲霉属等对多种植物病原菌具有抑制活性（汪滢等，2010;李艳玲等，2019）。

植物内生菌的研究手段主要是应用传统的人工培养法，但自然界中90%以上的微生物是不可培养或难以培养的（Amann et al.， 1995），现代高通量测序技术可以快速和正确地分析样品中微生物群落组成和丰度，并借助生态功能分析方法从分类学上解析真菌OTUs的生态功能，从而分析潜在的或可能起功能性作用的非培养类微生物（刘蓬蓬等，2018）。因此，本研究分析黄精根际真菌和药用部位内生真菌的群落结构，探讨药用部位根茎内生真菌的生态功能，为黄精药用功能菌群的发掘和代谢活性产物的研究提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 样品前处理

2019年8月，黄精根际土、根茎和根采自黑龙江省中医药大学药用植物园，经本校药学院苏连杰教授鉴定为黄精（Polygonatum sibiricum）。

采集新鲜、无伤病黄精植株3株，将根部土壤抖落后，留存剩余在根部的根际土壤于无菌袋中;所有样品迅速带回实验室后，用流水冲洗掉根茎和根表面多余的根际土后，无菌条件下，将根茎和根切成2 cm小段，置于培养皿中消毒，75%乙醇2 min，5%次氯酸3 min，无菌去离子水冲洗3次，最终获得根际土、根茎和根的无菌样品共计9份（王艳等，2019）。

1.2 真菌分子生物学鉴定

利用试剂盒（FastDNA spin kit）提取黄精根际、根茎和根真菌总DNA，每个样品3次生物学重复。选择真菌ITS测序通用引物 ITS1/ITS2 进行PCR扩增，经2%琼脂糖凝胶电泳检测（付亚娟等，2019）。PCR产物回收纯化后，利用Illumina MiSeq PE300平台上机测序（美吉生物公司，上海）。

1.3 序列分析和数据处理

使用FLASH软件、QIIME软件、RDP classifier软件、Mothur软件等，对原始下机序列进行生物信息学分析（周家喜等，2019），在相似性97%的水平上，进行可操作分类单元（OTU）划分。利用 FUNGuild 软件预测黄精根茎内生真菌的生态功能（Nguyen et al.， 2016），为保证预测的准确性，置信水平仅选用highly probable和probable，并删除序列数小于10的OTUs。

黄精根际、根茎和根的真菌多样性指数和群落组成差异利用SPSS 19.0软件进行分析，用RStudio v3.5.2的程序包Grid、Venn Diagram、Vegan、ggrepel、ggplot等实现数据可视化：韦恩图（Venn）、主成分分析图（PCA）、热图（Heatmap）和多级物种Sunburst图等。

2 结果与分析

2.1 黄精根际及内生真菌群落多样性

黄精根际土、根茎和根共计9个样品，共获得623 708条有效序列数。Coverage指数接近于1，说明测序结果可以准确地反映供试样品的真实情况（表1）。相似度为0.97条件下，黄精根际真菌的Shannon指数、Ace指数和Chao 1指数分别为3.77±0.15、460.1±12.1和465.6±10.1，显著高于根茎和根内生真菌（P<0.05），说明黄精根际土中真菌群落多样性和物种丰富度最高。黄精根茎和根内生真菌Simpson指数显著高于根际土，说明根茎和根中内生真菌群落多样性较低。

第一和第二主轴解释了OTU水平真菌群落变化的91.86%，来自相同部位的样品相对聚集，不同部位样品中真菌有较高程度的分离，表明黄精根际、根茎和根真菌群落组成差异显著（图1）。

2.2 黄精根际及内生真菌群落组成

根际土中真菌OTU数目远大于根和根茎真菌OTU数目，分别为703、141、128（图2）。根际土、根茎和根中共有的OTU数目为41个，包括真菌类群Setophoma（OTU1332）、篮状菌属（Talaromyces）（OTU1449、OTU261）、肉座菌目（Hypocreales）（OTU978、OTU1379）、新赤壳属（Neocosmospora）（OTU411、OTU1370）等，说明黄精根际土、根茎及根样品间微生物既存在一定的交集，又相互独立。根际土与植物中真菌的OTU数为128，仅占总数的15.94%，交叉性较小。

黄精根际土、根茎和根中共14门36纲77目158科286属398种真菌，在门水平主要分布在子囊菌门（Ascomycota）（27.85%～83.98%）、未知菌门（unclassified_k_Fungi）（1.17%～62.58%）、担子菌门（Basidiomycota）（2.64%～29.06%）、球囊菌门（Glomeromycota）（1.57%～6.68%）、Mortierellomycota（0.19～4.40%）、壶菌门（Chytridiomycota）（1.28%）等6个门中（图3：a）。药用部位根茎内生真菌中主要分布于子囊菌门（83.98%）和担子菌门（10.82%）;根茎内生真菌子囊菌门的含量显著高于根际土和根中，根际土中担子菌门和Mortierellomycota的含量顯著高于根茎和根中，且存在特有的门，即壶菌门（图3：b）。

从属水平的分类看（图4），黄精根际土真菌263属，显著高于根茎（72属）和根（67属）中内生真菌数量，但在根际土、根茎和根中缺少共有优势菌属（相对丰度≥10%）。多级物种Sunburst图显示：药用部位根茎内生真菌中相对百分含量前5的有Setophoma（23.71%）、肉座菌目的未鉴定属（19.36%）、新赤壳属（8.48%）、棘壳孢属（Pyrenochaeta）（5.17%）和Cutaneotrichosporon（4.03%），前4属均属于优势菌门，即子囊菌门（图5）。

2.3 共有的类群组成与比较分析

黄精根际土、根茎及根样品间共有OTU 41个，归属于6门12纲24目31科35属，在门水平上，子囊菌门具有最大相对丰度，占共有真菌的58.15%，其次是未鉴定真菌（22.14%）、担子菌门（14.24%）、球囊菌门（3.74%）和Mortierellomycota（1.95%）等。

在属水平上，相对丰度较大的是Setophoma，占共有真菌的13.02%，其次分别是篮状菌属（11.34%）、肉座菌目的未鉴定属（11.12%）、新赤壳属（5.65%）、角担菌科（Ceratobasidiaceae）的未鉴定属（4.23%）、镰刀菌属（Fusarium）（2.84%）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）的未鉴定属（2.78%）、球囊霉属（Glomus）（2.59%）、棘壳孢属（2.29%）、Cutaneotrichosporon（2.00%）等35属。

2.4 FUNGuild功能类群预测

除未鉴定菌群外，黄精药用部位根茎内生真菌（删除OTU<10）共有106个OTU，划分为6个生态功能群（图6），分别是（1）未定义腐生菌（undefined saprotroph）和未定义腐生菌-木腐生菌（undefined saprotroph-wood saprotroph）：共27个OTU，占总OTU数量的25.47%，相对丰度高达44.85%，是黄精根茎中最主要的功能类群，在属水平上包括曲霉属（Aspergillus）（3 OTU）、新赤壳属（2 OTU）、篮状菌属（2 OTU）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）（2 OTU）、Dactylonectria（1 OTU）和青霉属（Penicillium）（1 OTU）等。（2）寄生真菌-植物病原菌-木腐生菌（fungal parasite-plant pathogen-wood saprotroph）：3个OTU，在属水平上是Setophoma（2 OTU）、Paraphoma（1 OTU），占总OTU数量的2.83%，但其相对丰度高达24.32%。（3）动物病原菌（animal pathogen）：仅有2个OTU，在科水平均属于油壶菌科（Olpidiaceae）。（4）植物病原菌（plant pathogen）：6个OTU，在属水平上分别是小球腔菌属（Leptosphaeria）（1 OTU）、螺旋聚孢霉属（Clonostachys）（1 OTU）和赤霉属（Gibberella）（2 OTU）等。（5）丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi）：11个OTU，均属于球囊菌门（Glomeromycota）。（6）地衣共生真菌（lichenized fungi）：仅有1个OTU被认为是地衣共生真菌，属于拟星衣科（Arthopyreniaceae）。另外，19个OTU在FUNGuild数据库的置信水平为possible，故不进行功能统计，并且有37个OTU（占比34.91%）中没有参考信息。

3 讨论与结论

内生真菌能够产生与药用植物相同或相似的活性成分（Tian et al.， 2014; Sunil et al.， 2018），研究者已从黄精中分离出可合成具有抗菌活性的三萜皂苷的内生真菌（汪滢等，2010;姜程曦等，2017），我们利用高通量测序手段从黄精根际土、根茎和根中测序得到丰富的内生真菌群，其中链格孢属（Alternaria）、镰刀菌属、曲霉属和青霉属已经在泰山黄精中通过传统的平板分离的方法获得（李艳玲等，2013），但相对丰度较低，除此之外，我们发现黄精中大量的内生真菌还未见报道有待深入发掘，可见高通量测序手段较传统的菌落分离，更能全面反映样品内生真菌群落的结构组成，与Siddique et al.（2017）意见一致。

土壤真菌以植物根系作为中间体，并以菌丝或者孢子的形式，通过植物侧根的裂缝、气孔或者根部的破损等处进入植物的根和根茎中，参与药用植物活性成分的合成（周家喜等，2019）。黄精根际土真菌与植物内生真菌共有128个OTU，占植物总OTU的56.64%，说明土壤和植物中的真菌存在一定的相似性，根际真菌有机会选择性地进入到植物体内，并成为内生真菌，与周婕等（2019）对紫茎泽兰根部与根际真菌的研究结果一致。同时，共有OTU仅占根和根茎内生真菌的29.07%和32.03%，说明除了共有成分外，在黄精根和根茎中拥有更多独立的真菌类群，这与王艳等（2019）对重楼内生真菌的研究结果一致，认为植物内部有其自身特殊的生境，是植物与微生物间协同进化的结果。

FUNGuild预测结果显示，黄精根茎中未定义腐生菌类群（相对丰度44.85%）占比最高，与周家喜等（2019）、熊丹等（2020）的研究结果一致，认为未定义腐生菌是地下部分根和根茎中的主要功能类群，并且很多研究发现腐生菌类群能够参与有机物降解（Yan et al.， 2018;Chen et al.， 2019）。植物内生真菌在发育学上不稳定，在植物的不同生活周期中扮演不同的角色，一些具有复杂生活史的真菌有多种功能营养型可以相互转化，采取不同的生存策略来适应环境的改变（Arnold & Lutzoni， 2007），在FUNGuild分类上可以被划分多种营养方式（熊丹等，2020）。在本研究中，优势菌属Setophoma（相对丰度23.71%）被认定是寄生真菌-植物病原菌-木腐生菌，推测其在植物组织健康生长的时候是寄生真菌，有增加植物生长量的能力，但也可以产生植物毒性成分导致植物生长受到抑制， 但当组织衰老或死亡时可能作为腐生真菌，參与有机物降解，与丁常宏等（2013）的意见一致。

黄精根茎内生真菌中3个OTU属于新赤壳属（相对丰度8.48%），被划分为未定义腐生菌，Matsuo et al.（2019）发现新赤壳属真菌具有抗肿瘤和抗疟疾的活性，以及清除或淬灭活性氧（ROS）的能力;黄精根茎中球囊菌门的11个OTU，均被划分为丛枝菌根真菌，已有学者发现丛枝菌根真菌与植物互惠共生，提高萜类、生物碱等药用植物活性成分的产量（于洋等，2013;谢伟等，2020），尤其曹冠华等（2019）发现滇黄精根茎中多糖、薯蓣皂苷元含量与丛枝菌根真菌呈显著正相关，这说明黄精入药部位根茎中的优势内生真菌可能与活性代谢产物合成有关。我们今后还需进一步加强菌株分离和功能试验，对黄精有效部位根茎中微生物的有效成分合成代谢进行更加深入的研究。

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（责任编辑 周翠鸣）