王诗雅 ，郑殿峰 ，冯乃杰 ，梁喜龙 ，3，项洪涛 ，冯胜杰 ，王新欣 ，左官强

（1. 黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江大庆163319；2. 广东海洋大学滨海农业学院，广东湛江524088；3. 黑龙江八一农垦大学植物生长调节剂工程技术研究中心，黑龙江大庆163319；4. 黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所，黑龙江哈尔滨150086）

大豆（Glycine max）起源于中国，随后于18 世纪传入欧洲和美洲，是世界上最重要的豆科作物之一［1−2］。世界大豆总种植面积为1.2 亿hm2，而中国大豆的种植面积为0.065 亿hm2，约占全球总种植面积的5.4%［3］。黑龙江是中国优质大豆的主产区，种植面积占全国的50.1%［4］。黑龙江地处中国最北部，是典型的“气候脆弱区”，夏季降水率变大，时空分布不均，且大雨、暴雨较为集中，加之黑龙江地势平坦，农田排水困难，较易形成涝灾［5−6］，对大豆生长构成严重威胁。

涝渍胁迫是季节性发生的环境灾害，也是作物生长发育过程中遭受的主要非生物胁迫之一，对作物产量和品质的提升造成严重的负面影响［7］。正常条件下，植物体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）在抗氧化物酶调节下维持在一个恒定水平，但在逆境胁迫下ROS 的产生和清除机制受到破坏，可导致植物细胞受损［8］。研究指出，作物在胁迫下产生的ROS 和过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）具有破坏性，可导致酶失活和膜脂过氧化，甚至使细胞死亡［9−10］。抗坏血酸−谷胱甘肽（ascorbate-glutathione，AsA-GSH）循环是植物抗氧化防御系统的重要组成部分，主要由抗氧化物质还原型抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）和还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）与抗坏血酸过氧化物酶（aseorbate peroxidase，APX）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）及脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbatereductase，DHAR）组成［11−12］。研究表明，植物体内 AsA-GSH 循环的快速运转，能减轻 ROS 对植物的伤害［13］。郭欣欣等［14］研究指出，淹水胁迫导致不结球白菜（Brassica rapassp.chinensis）根系中H2O2含量和超氧阴离子产生速率（superoxide anion production rates，O2—·）显著增加，且随胁迫时间延长，对不结球白菜的伤害越大，在淹水胁迫初期通过保持较高的关键酶活性，来抵御胁迫造成的损伤。齐玉军等［15］研究表明，淹水胁迫可使大豆膜脂过氧化程度增加和ROS 积累，使细胞膜受损，AsA 和GSH 作为非酶类可直接清除O2—·，APX、GR 等酶活性的增加可减少 H2O2含量对细胞膜的氧化攻击。因此，AsA-GSH 循环是植物清除ROS 的酶促催化系统，在植物抵抗氧化胁迫、清除逆境ROS 积累方面具有重要作用［16−17］。

烯效唑（uniconazole，S3307）作为一种重要的植物生长延缓剂，可提高作物的抗逆性［18］，目前被广泛应用，前人对S3307 在各种作物上的应用效果也进行了大量研究和报道，发现其可有效提高作物的光合作用［19−20］，提高酶活性［21］，增强作物对逆境的抵抗力［22−24］。S3307 通过提高作物内非酶抗氧化剂和渗透调节物质含量，提高抗氧化酶活性，进而减少ROS 的积累，维持ROS 代谢平衡，进而可缓解逆境对作物造成的伤害［25−26］。目前，淹水胁迫对大豆AsA-GSH 循环的影响研究较少，且关于S3307 缓解大豆淹水伤害的相关研究也尚未报道。因此，本试验以耐涝性不同的2 个大豆品种为材料，探究S3307 对淹水胁迫下大豆叶片ROS 及AsA-GSH 循环中关键酶和抗氧化剂的影响，旨在为S3307 提高大豆的耐涝性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用耐涝品种‘垦丰14’和涝渍敏感品种‘垦丰16’为大豆试验品种［27］。供试生长调节剂选用烯效唑（S3307），由黑龙江八一农垦大学植物生长调节剂工程技术研究中心提供。

1.2 试验设计与处理

试验于2019 年在黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心盆栽场进行，采用带有隔水层和排水口的树脂花盆（上口径×底径×高=32 cm×23 cm×31 cm）进行盆栽试验。试验用土为栽培土、腐殖土和沙子按7∶2∶1 体积比例混合组成，每盆装土18 kg。5 月19 日进行播种，试验共设6 个处理，4 个单元为一个处理，每盆播种10 粒，子叶期定苗5 株，具体设计见表1。待植株生长至R5 期（鼓粒期，播种后95 d），进行叶面喷施S3307（浓度为 50 mg·L−1，喷施量为 225 L·hm−2），并于喷药后第 5 天（播种后 100 d，淹水胁迫处理第 0 天，简称 R5+5）进行淹水处理（套盆淹水，水淹没土表面高于土面2～3 cm 为准），淹水持续5 d（播种后第105 天，淹水第5 天，简称R5+10），5 d 后（播种后110 d，简称R5+15）放水恢复正常水分管理。处理期间，在上述3 个时间点进行取样，每次选取4 株并采集功能叶片（倒三叶），各处理分别取样后立即放入液氮中，而后置于−80 ℃冰箱中保存，供测定生理指标使用。

表1 试验设计方案Table 1 Experiment design

1.3 测定项目及方法

按照高俊凤［28］的方法测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧阴离子（O2—·）产生速率、还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（glutathiol，GSSG）含量和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性；采用碘化钾法［29］测定过氧化氢（H2O2）含量；采用 Zhang 等［30］的方法测定还原型抗坏血酸（AsA）和氧化型抗坏血酸（dehydroascorbate，DHA）含量；根据 Zhu 等［31］的方法测定谷胱甘肽还原酶（GR）活性；根据 Murshed 等［32］的方法测定脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性。采用试剂盒法（Solarbio 公司）测定单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2013 进行数据录入及整理，用SPSS 25 作方差分析，用Origin 2018 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片膜脂过氧化程度的影响

由图 1 可知，（R5+5）d 时，与各自对照相比，S3307 处理有效降低了两大豆品种叶片的MDA 含量，但未达显著差异水平。（R5+10）d 时，淹水胁迫下两大豆品种叶片内MDA 含量显著增加，其中，T2较T1显著增加37.69%，T5较T4显著增加70.09%；而与淹水胁迫相比，S3307 处理显著降低淹水胁迫下两大豆品种叶片内MDA 含量，其中，T3较T2降低4.57%，T6较T5降低24.69%，各处理间均达显著差异水平。恢复正常水分处理5 d（R5+15）后，T2和T5的叶片内MDA 含量虽有降低，但仍高于T3和T6，且二者显著高于两品种的对照（T1和T4），说明叶面喷施S3307 可缓解淹水胁迫对大豆叶片膜脂过氧化的损伤，减轻淹水胁迫造成的伤害。

图1 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片MDA 含量的影响Fig. 1 Effects of S3307 on MDA content in leaves of soybean under waterlogging stress at R5 stage

2.2 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片O2—·产生速率和H2O2含量的影响

由图 2 可知，（R5+5）d 时，与对照（T1和 T4）相比，S3307 处理有效抑制垦丰 14 和垦丰 16 叶片内 O2—·产生速率，其中T3较T1降低6.77%，达显著差异水平；T6较T4降低5.77%，未达显著差异水平。（R5+10）d 时，两大豆品种叶片内O2—·产生速率在淹水胁迫下与对照相比显著增加，其中T2较T1显著增加55.75%，T5较T4显著增加32.05%。S3307 处理则有效抑制了两大豆品种叶片内O2—·的产生速率，其中与T2相比T3略有降低，未达显著差异水平；T6较T5显著降低15.81%。恢复正常水分处理［（R5+15）d］后，淹水胁迫处理的垦丰14 T2和垦丰16 T5叶片内O2—·产生速率明显降低，但高于两品种S3307 处理，且均高于对照，其中垦丰14 T3处理恢复至T1水平，说明S3307 处理可抑制叶片内O2—·产生速率，且S3307 处理后，耐涝品种恢复能力强于涝渍敏感品种。

（R5+5）d 时，与对照（T1和 T4）相比，S3307 处理显著降低了 T3和 T6叶片内 H2O2含量，其中 T3较 T1显著降低2.72%；T6较 T4显著降低 1.85%（图 2）。（R5+10）d 时，垦丰 14 和垦丰 16 变化趋势相同，淹水胁迫处理显著增加了两大豆品种叶片内H2O2含量，垦丰14 T2较T1显著增加30.28%，垦丰16 T5较T4显著增加15.74%，S3307 处理可减少H2O2的积累，其中，垦丰14 T3较T2降低3.52%，垦丰16 T6较T5降低2.4%。恢复正常水分处理［（R5+15）d］后，垦丰14 T2和T3与R5+10 d 时相比变化趋势相同，但T2和T3的H2O2含量明显降低，方差分析结果表明T2和 T3均显著高于 T1；垦丰 16 T5和 T6与（R5+10）d 后相比略有降低，T5显著高于 T6和 T4，T6显著高于 T4。说明，叶面喷施S3307 后，耐涝品种垦丰14 在恢复正常水分处理后可有效抑制H2O2含量的积累，减缓胁迫对叶片的伤害；而对于涝渍敏感品种垦丰16 来说，淹水胁迫后叶片恢复能力较慢，淹水胁迫所造的伤害较大。

2.3 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片AsA 和DHA 含量的影响

由图 3 可知，（R5+5）d 时，垦丰 14 和垦丰 16 在 S3307 处理下（T3和 T6）与各自对照（T1和 T4）相比，显著增加了叶片内 AsA、DHA 和 AsA+DHA 含量，其中 T3较 T1分别显著增加 4.44%、17.25%、3.02%；T6与 T4相比分别显著增加8.65%、2.50%、6.05%。（R5+10）d 时，垦丰14 和垦丰16 各处理之间高低趋势表现为：S3307＞淹水胁迫＞对照，且各处理间均达显著差异水平，说明淹水胁迫提高了叶片内AsA、DHA 和AsA+DHA 含量，S3307 可进一步促进上述指标的增加。恢复正常水分处理［（R5+15）d］时，两品种淹水胁迫和S3307 处理均有所降低，但S3307 处理仍显著高于淹水胁迫处理，说明S3307 在恢复正常水分胁迫仍可使上述指标保持较高的含量，可有利于ROS 的清除。

2.4 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片GSH 和GSSG 含量的影响

由图 4 可知，（R5+5）d 时，S3307 处理提高了 T3叶片内 GSH、GSSG 和 GSH+GSSG 含量，分别较 T1增加11.97%、15.35%、14.12%，达显著差异水平；S3307 处理也提高了 T6叶片内 GSSG 和 GSH+GSSG 含量，T6较T4分别显著增加19.16%和9.35%，但对提高GSH 含量效果不明显。（R5+10）d 时，垦丰14 和垦丰16 各处理之间高低趋势分别表现为T3＞T2＞T1和T6＞T5＞T4，方差分析结果表明各处理之间差异显著，说明叶面喷施S3307 可提高淹水胁迫下大豆叶片内GSH、GSSG 和GSH+GSSG 含量。恢复正常水分处理［（R5+15）d］后，垦丰14 和垦丰16 淹水胁迫和S3307 处理与（R5+10）d 时相比明显降低，但高低顺序保持不变，说明恢复正常水分处理后，S3307 可维持垦丰14 和垦丰16 叶片内GSH、GSSG 和GSH+GSSG 含量，进而防止淹水胁迫对细胞膜的损伤，提高大豆的耐涝性。

图4 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片GSH、GSSG 和GSH+GSSG 含量的影响Fig. 4 Effects of S3307 on GSH and GSSG and GSH+GSSG content in leaves of soybean under waterlogging stress at R5 stage

2.5 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片关键酶活性的影响

2.5.1 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片APX 活性的影响 由图5 可知，（R5+5）d 时，与各自对照（T1和T4）相比，S3307 处理（T3和 T6）显著提高了垦丰 14 和垦丰 16 叶片内 APX 活性，其中，T3较 T1增加 23.53%，T6较T4增加 26.83%。（R5+10）d 时，两大豆品种淹水胁迫处理（T2和 T5）的叶片内 APX 活性显著增加，S3307 处理（T3和T6）后可进一步促进淹水胁迫下APX 活性的增加。恢复正常水分处理［（R5+15）d］后，垦丰14 和垦丰16 淹水胁迫和S3307 处理APX 活性均有所下降，且高低趋势与（R5+10）d 时相同，但 S3307 处理仍保持较高水平，说明恢复正常水分后，S3307 处理可维持较高的APX 活性，进而有效清除淹水胁迫产生的H2O2。

图5 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片APX 活性的影响Fig. 5 Effects of S3307 on APX activity in leaves of soybean under waterlogging stress at R5 stage

2.5.2 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片GR 活性的影响 由图 6 可知，（R5+5）d 时，S3307 处理对两大豆品种叶片内GR 活性无明显影响。（R5+10）d时，垦丰14 和垦丰16 各处理之间高低趋势表现为T3＞T2＞T1和 T6＞T5＞T4，各处理间均达显著差异水平，说明淹水胁迫可提高叶片内GR 活性，以抵御淹水胁迫造成的伤害，喷施S3307 后，可进一步促进叶片内GR 活性的提高。恢复正常水分处理［（R5+15）d］后，T3和 T2处理与（R5+10）d 时相比显著下降，但趋势相同；垦丰 16 T6和 T5与（R5+10）d 时相比略有降低，但T6仍保持较高水平。S3307 可延缓两大豆品种叶片内GR 活性降低，但恢复正常水分处理后，涝渍敏感品种垦丰16 淹水胁迫处理降幅略小，说明涝渍敏感品种淹水后恢复能力较差。

图6 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片GR 活性的影响Fig. 6 Effects of S3307 on GR activity in leaves of soybean under waterlogging stress at R5 stage

2.5.3 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片MD⁃HAR 活 性 的 影 响 由 图 7 可 知 ，（R5+5）d 时 ，S3307 处理后T6叶片内MDHAR 活性与T4相比增加24.61%，达显著差异水平；但S3307 处理对垦丰14 叶片内MDHAR 活性的增加效果不明显。（R5+10）d时，显著增加两品种叶片内MDHAR 活性，且叶面喷施烯效唑后可进一步促进MDHAR 活性的提高，其中垦丰14 各处理之间高低趋势表现为T3＞T2＞T1，垦丰16 各处理之间高低趋势表现为T6＞T5＞T4，方差分析表明各处理之间差异显著。恢复正常水分处理［（R5+15）d］后，垦丰 14 T3降幅小于 T2，T2恢复至 T1水平；垦丰16 T6降幅小于T5，T5恢复至T4水平。说明恢复正常水分处理后，叶面喷施S3307 具有延缓叶片内MDHAR 活性的作用。

图7 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片MDHAR 活性的影响Fig. 7 Effects of S3307 on MDHAR activity in leaves of soybean under waterlogging stress at R5 stage

2.5.4 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片DHAR 活性的影响 由图8 可知，（R5+5）d 时，S3307 处理对垦丰 14 和垦丰 16 叶片内 DHAR 活性无显著影响。（R5+10）d 时，垦丰 14 各处理之间高低趋势表现为 T3＞T2＞T1，垦丰16 各处理之间高低趋势表现为T6＞T5＞T4，方差分析表明各处理之间差异显著，淹水胁迫增加了两大豆品种叶片内DHAR 活性，S3307 处理可进一步促进两大豆品种叶片内DHAR 活性的提高。恢复正常水分处理［（R5+15）d］后，垦丰 14 和垦丰 16 淹水胁迫和 S3307处理DHAR 活性均有所下降，但淹水胁迫处理的降幅大于S3307 处理，且各处理间高低趋势与（R5+10）d时相同，说明在恢复正常水分处理后，S3307 处理的两大豆品种叶片内DHAR 活性可保持较高水平，延缓了DHAR 活性的降低，增强清除ROS 的能力。

图8 烯效唑对R5 期淹水胁迫下大豆叶片DHAR 活性的影响Fig. 8 Effects of S3307 on DHAR activity in leaves of soybean under waterlogging stress at R5 stage

3 讨论

3.1 R5 期淹水胁迫及S3307 处理对大豆膜脂过氧化程度的影响

MDA 是膜脂过氧化的主要产物，会对植物细胞产生氧化胁迫并导致膜系统损伤，造成氧化伤害，因此，MDA 含量的高低可直接反应膜脂过氧化的程度，常用作判断胁迫损伤程度的指标［33］。MDA 可与膜上的蛋白质、酶等结合，从而引起蛋白质分子内和分子间的交联，最终破坏膜的完整性以及丧失选择透过性，引起质膜透性的升高，膜系统受到损伤［34］。本试验结果表明，R5期淹水胁迫导致垦丰14 和垦丰16 叶片内MDA 含量大幅增加，加剧了膜脂过氧化程度，且涝渍敏感品种垦丰16受到的胁迫程度大于耐涝品种垦丰14，这与于奇等［24］对绿豆（Vigna radiata）的研究结果一致。研究表明，S3307能够影响植物体内自由基和△-二氢吡咯-5-羧酸合成酶的合成，自由基作用于膜脂过氧化合成，最终产物是MDA，S3307 处理可抑制自由基的合成，并降低MDA 含量，提高作物的耐寒性［22］。本试验结果表明，叶面喷施S3307 后，可抑制淹水胁迫下两品种叶片内MDA 含量的增加，并在恢复正常水分处理后显著降低，与耐涝品种垦丰14 相比涝渍敏感品种垦丰16 恢复较慢，说明外施S3307 可缓解淹水胁迫对大豆叶片膜脂过氧化程度的影响，增强大豆的耐涝性。

3.2 R5 期淹水胁迫及S3307 处理对大豆活性氧代谢的影响

ROS 是植物生长发育中非常重要的角色，正常条件下浓度较低，主要作为信号分子调节植物的生长发育；当受到逆境胁迫时，植物体内的ROS 会急剧积累，而高浓度的ROS 会直接影响细胞的正常发育［35］，加快O2—·产生速率和增加H2O2含量，进而破坏膜脂过氧化程度，抑制植物正常生长发育。本试验结果表明，淹水胁迫导致两品种叶片内O2—·产生速率显著增加，这与于奇［36］研究淹水胁迫对绿豆O2—·产生速率影响的结果类似。同时，淹水胁迫还增加了两大豆品种叶片内H2O2含量，与对照相比，分别增加了1.48 和1.43 倍。研究指出，S3307 处理后可降低ROS 过度积累造成的膜损伤，提高作物在逆境胁迫下的耐受性［37］。本试验表明，S3307 可有效降低淹水胁迫下两大豆品种叶片内O2—·产生速率和H2O2含量的积累，说明S3307 对维持ROS 平衡具有积极作用。

3.3 R5 期淹水胁迫及S3307 处理对大豆AsA-GSH 循环的影响

当植物处于淹水胁迫状态时，细胞内正常的ROS 代谢平衡会遭到破坏，进而影响植物的正常生长代谢［38］。前人曾指出，为应对氧化胁迫，植物体内进化出复杂的防御系统，其中，AsA、GSH 含量和AsA-GSH 循环中关键酶活性可起到清 除 ROS 的作用［16］。APX 可 催化 AsA 清除 H2O2生成 MDHAR，且 MDHAR 可协同 APX 清除H2O2；GR 可生成 AsA 进一步降低氧化应激［39−40］。本研究结果表明，淹水胁迫可导致两大豆品种内 APX、GR 和MDHAR 活性升高，说明在淹水胁迫下，H2O2的产生促使两大豆品种叶片APX、GR 和MDHAR 活性的增加，以清除过量的H2O2，该结果与齐玉军等［15］研究淹水胁迫对大豆AsA-GSH 循环中关键酶活性的影响相似。外施S3307 后，可进一步促进上述3 种酶活性的增加，说明S3307 增强了清除H2O2的能力。DHAR 是存在于AsA 和DHA 之间的一种关键酶，在GSH 存在的条件下，催化DHA 向AsA 转变［41］。本研究表明，淹水胁迫下DHAR 含量也呈增加趋势，且S3307 处理后进一步增加了DHAR 活性，说明S3307 可促进DHAR 活性的提高，有助于AsA的产生。恢复正常水分处理后，淹水胁迫解除，抗氧化酶活性降低，但未能恢复至正常生理状态，说明淹水胁迫对叶片的伤害较大；S3307 处理的叶片内关键酶活性和在胁迫解除后维持较高水平，说明S3307 具有延缓关键酶活性降低的作用。AsA 和GSH 是重要的抗氧化剂，可降低O2—·产生速率，并催化 H2O2生成 H2O 和 O2，促进膜蛋白的稳定性，同时，也可作为清除ROS 的调控信号［42−43］。本试验结果表明，淹水胁迫导致叶片内AsA、GSH、DHA、GSSG、AsA+DHA 和GSH+GSSG 含量显著增加，S3307 处理后对上述指标有更明显的促进作用，维持更高的抗氧化能力。胁迫解除后，S3307 可保持较高的抗氧化剂含量，有助于两大豆品种快速恢复至正常生理状态。

4 结论

R5 期，叶面喷施S3307 能有效提高大豆叶片AsA-GSH 循环中非酶抗氧化剂和关键酶活性，维持大豆的正常生长发育；淹水胁迫后导致大豆叶片内ROS 积累和膜质过氧化程度的提高，且涝渍敏感品种垦丰16 的增幅大于耐涝品种垦丰14，同时，促进AsA-GSH 循环中非酶抗氧化剂和关键酶活性的提高，是大豆对淹水胁迫所产生的应激反应，通过两者的协同作用，抵抗ROS 和MDA 对细胞造成的伤害，两品种非酶抗氧化剂和关键酶活性虽有提高，但垦丰16 的幅度低于垦丰14，说明垦丰16 受到的伤害大于垦丰14。叶面喷施50 mg·L−1S3307 具有抵御淹水胁迫，减缓作物受损的作用，增加淹水胁迫下关键酶活性和抗氧化剂含量，有效减少ROS 积累，并维持ROS代谢平衡，缓解淹水胁迫对大豆造成的氧化损伤，在恢复正常水分处理后，通过保持较高的非酶抗氧化剂含量和关键酶活性，促进两大豆品种恢复至正常生长状态。