邹诗雨 ，陈思葵 ，唐启源 ，陈东 *，陈元伟 ，邓攀 ，黄胥莱 ，李付强

（1. 湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙410128；2. 湖南农业大学农学院，湖南长沙410128；3. 湖南天华实业有限公司，湖南娄底417000）

近年来，随着我国草食畜牧产品产量的持续增长和养殖规模化的持续推进，牧场对于优质粗饲料和蛋白质饲料的依赖程度越来越高。但是，由于我国饲草种植成本较高，造成了优质粗饲料和蛋白质饲料的短缺以及饲养成本高等问题，制约了我国畜牧业的发展。水稻（Oryza sativa）是世界上主要的粮食作物之一，而再生稻作为水稻种植的一种模式，具有种植成本低、经济效益高的特点。据各地热量资源测算，中国南方稻区适宜发展再生稻的耕地面积约335 万hm2，而实际种植面积只有40 万hm2，由于再生稻必须在温、光、水条件适宜的地区种植才能保证其稳产高产，且对品种要求严格，再生稻作为粮食作物的应用受到了限制，但是作为饲料原料的应用仍具有广阔的发展前景［1］。本研究通过提前将再生稻头季进行全株刈割，并在添加不同青贮剂后进行青贮，延长其再生季生育期，在大幅提升再生季稻谷产量的同时，为草食动物提供稳定且质量保障的青贮饲料。

添加青贮剂能有效提高青贮发酵品质，某些添加剂（乳酸菌、纤维素酶等）还能提高青贮饲料的营养价值［2］。植物乳杆菌可以在厌氧发酵的起始阶段，通过高效利用饲料作物中的可溶性碳水化合物快速发酵产生乳酸和降低pH，从而有效地改善青贮饲料的品质［3］。粪肠球菌可以加快产生乳酸，使pH 值迅速降低至5.0 以下，有利于乳酸菌的发酵［4］。纤维素酶和木聚糖酶可以降解植物细胞壁，将纤维素和木聚糖分解为可溶性碳水化合物，为乳酸菌的繁殖提供更多的底物，同时也能提高青贮饲料的消化率［2］。目前青贮剂对青贮品质和体外瘤胃发酵特性的影响主要集中在全株玉米和苜蓿等［5−6］方面，且再生稻头季全株青贮发展起步较晚，研究主要集中在稻秸的青贮剂选择［7］、品种特性［8］和混合青贮技术［9］上，添加不同青贮剂对再生稻头季全株青贮品质和体外瘤胃发酵特性的影响研究还鲜见报道。本研究以再生稻头季全株为研究对象，评价不同青贮剂对再生稻头季全株的青贮品质和青贮后体外瘤胃发酵的影响，为商品化再生稻头季全株青贮饲料的开发和利用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 青贮试验

1.1.1 青贮调制 2018 年8 月于益阳市大通湖区千山红镇大西港村进行青贮试验。青贮原料为2018 年大通湖区宏硕生态农业农机合作社试验地种植的水稻（湘两优900），刈割时期为齐穗后25 d、留茬高度为20 cm，切碎至2～3 cm 待用。青贮原料营养水平见表1。

表1 青贮原料营养水平（风干基础）Table 1 Nutrient levels of silage raw materials（air-dry basis，%）

试验所用植物乳杆菌、粪肠球菌、纤维素酶、木聚糖酶和半纤维素酶为湖南普菲克生物科技有限公司赠送，采用单因素完全随机设计，青贮剂处理组分别为1 组（N1）：植物乳杆菌（60%）+纤维素酶（30%）+木聚糖酶（10%）；2 组（N2）：植物乳杆菌（70%）+粪肠球菌（20%）+纤维素酶（5%）+半纤维素酶（5%）；3 组（N3）：植物乳杆菌（30%）+粪肠球菌（60%）+纤维素酶（5%）+半纤维素酶（5%）；对照组添加等量的水（CK）。将不同青贮剂（添加量为500 g·t−1FW）溶液分别均匀地喷洒在混合青贮料上并充分混匀，分别装入聚乙烯袋（200 mm×300 mm）中，用真空包装机（诺丰DZ400/2D）抽真空模拟裹包青贮，在室温条件下（25 ℃左右）贮藏45 d 后进行开包取样，每组6 个重复。

1.1.2 青贮后营养物质评定 各组逐一开启青贮袋并混匀后，按“四分法”［10］得到分析样品，每个重复600 g 左右，然后进行粉碎，一部分过0.425 mm 孔筛，进行营养物质成分干物质（dry matter，DM）、粗蛋白质（crude protein，CP）、粗脂肪（ether extract，EE）、中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）、可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC）含量的检测；另一部分过0.250 mm孔筛，于清洁干燥处保存，之后进行体外瘤胃发酵批次培养。

1.1.3 青贮发酵特性评定 青贮袋开启后，各组按“四分法”［10］称取20 g 青贮饲料，加入180 mL 去离子水，用榨汁机（九阳JYL-C012 型多功能搅拌机）榨汁1 min，匀质液用4 层纱布过滤，测定pH。滤液用于测定氨态氮（ammoniacal nitrogen，NH3-N）和挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）含量。

1.2 体外发酵试验

1.2.1 供体动物饲养管理 2018 年12 月于湖南农业大学动物科学技术学院以再生稻头季全株青贮样品进行体外发酵试验。选择3 只安装永久性瘤胃瘘管、体况良好、体重［（25.0±2.0）kg］接近的成年湘东黑山羊羯羊作为体外瘤胃液供体动物，每日营养需要参考《肉羊饲养标准》（NY/T 816-2004）［12］1.3 倍维持需要设计，配制精粗比为40∶60 的饲粮。精料组成（风干基础）为：玉米47.00%，豆粕24.00%，麸皮22.00%，食盐0.77%，石粉2.23%，预混料4.00%。粗料为玉米秸秆，铡短，长度2～3 cm；精料经2.5 mm 筛粉碎。山羊自由饮水，单笼饲养，实行限饲，采食量设计为风干样500 g·d−1，每天08：00 和16：00 各等量饲喂1 次。预试期调整山羊采食量，确保试验期能完全采食。

1.2.2 人工瘤胃缓冲液与培养液配制 人工瘤胃缓冲液参照Menke 等［13］的方法进行配制。取520.2 mL 蒸馏水、0.1 mL 微量元素溶液、208.1 mL 缓冲溶液、208.1 mL 常量元素溶液和1.0 mL 刃天青溶液，于具塞玻璃瓶中，持续充入CO2气体，置于恒温水浴中预热至39.5 ℃待用。使用前加入62.4 mL 还原剂溶液，并继续充入CO2气体，直至缓冲液从蓝色转变红色，再变为近无色即可。试验当天晨饲前采集供体羊的瘤胃液1000 mL，置于预先通有CO2的保温瓶中，立即盖严瓶口，迅速带回实验室。将供体羊的瘤胃液混合均匀后经4 层纱布挤压过滤于接收瓶中，置于39.5 ℃水浴中保存，并持续充入CO2以确保瘤胃液处于厌氧环境。以体积比1∶4 将瘤胃液和已预热至39 ℃的人工瘤胃缓冲液混合均匀制成培养液。

1.2.3 体外发酵操作 采用 Menke 等［13］体外产气法，分别称取 N1、N2、N3和 CK 组的样品各 0.6 g 放入 200 mL发酵瓶中，并将其置入39.5 ℃恒温培养箱内预热30～60 min。取50 mL 培养液厌氧分装至200 mL 发酵瓶中（边操作边通入CO2），发酵瓶用橡胶塞和铝盖封口后，在（39.5±0.5）℃的水浴摇床中体外发酵24 h，每个样品设6个重复，同时做空白试验。发酵过程中，用具有1 mL 分度的100 mL 具塞注射器装体外产气管（Fortuna®，德国产）记录培养3、6、9、12 和24 h 的产气体积。在24 h 体外发酵结束后，迅速将发酵瓶放置在碎冰中终止发酵，用已编号并65 ℃烘干称重的尼龙布（50 μm）过滤，再经蒸馏水冲洗发酵瓶数次直至干净，确保发酵瓶内无残留物。待滤液置于接收瓶后，将尼龙布及滤渣小心无损地转移到烘箱中65 ℃烘干48 h 至恒重。

1.2.4 体外产气量与产气参数的计算

式中：GPt为样品在t时刻的产气量（mL）；Vt为样品发酵t小时后，玻璃管刻度读数（mL）；V0为样品在开始培养时的玻璃管刻度读数（mL）；W为样品干物质重量（mg）；GP空白为空白对照的产气量。

采用Φrskov 等［14］提出的数学模型对0～24 h 的产气规律进行拟合：

式中：GP为t时刻产气量；a为快速降解部分的产气量（mL）；b为慢速降解部分的产气量（mL）；c为慢速降解部分的产气速率（%·h−1）；a+b为潜在产气量（理论总产气量）（mL）；t为发酵时间（h）。

1.2.5 体外瘤胃发酵特性 发酵24 h 后迅速采用pH 计（UB-7 型；Denver Instrument 公司，美国）对每个发酵瓶中的发酵液进行pH 测定，并将发酵液分装到5 mL 离心管中，−20 ℃保存，测定其VFA 和NH3-N 的含量。

1.2.6 体外降解特性评定 将装有滤渣的尼龙布反复用水洗涤后，晾干，105 ℃烘4 h 后称重，测定其DM、CP、NDF 和ADF 含量，按以下公式计算体外瘤胃发酵底物的DM 降解率和营养物质瘤胃降解率：

DM降解率=[(放入发酵瓶前底物重−终止发酵后残留底物重)/放入发酵瓶前底物重]×100%

某营养物质的降解率=［（发酵前该营养物质的含量−发酵后该营养物质的含量）/发酵前该营养物质的含量］×100%

饲料样品在体外发酵24 h 的产气量与绵羊体内有机质（organic matter，OM）降解率之间呈显著的正相关［13］，体外OM 降解率公式为：

式中：GP（gas production）为 24 h 产气量；CP 为粗蛋白质含量。

1.3 指标测定方法

DM、CP 或总氮（TN）、NDF、ADF 及 EE 的测定分别按 GB/T 6435-2006［15］、GB/T 24318-2009［16］、GB/T 20806-2006［17］、NY/T 1459-2007［18］及 GB/T 6433-2006［19］的 方法进行，参 考 Zahiroddini 等［20］的方法 测 定 WSC 含量，总能（gross energy，GE）的测定采用氧弹燃烧法进行。用 Spectrum 公司 SI400 型 pH 计测定 pH［21］。通过装有检测器和HP-INNOwax（30.0 m×320 μm×0.5 μm，Catalog No：19091N-213）毛细管色谱柱的气相色谱仪（GC-2010；Shimadzu Corporation，日本）测定 VFA 含量［22］，主要测定乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸和正戊酸 5 种 VFA 含量。采用T/CAAA 003-2018［23］中的苯酚−次氯酸钠比色法测定滤液NH3-N 含量。

1.4 数据分析

数据经Excel 2010 整理后，利用SPSS 23.0 统计软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准误表示，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 青贮剂对再生稻头季全株营养物质的影响

如表 2 所示，再生稻头季全株青贮在添加 N1、N2和 N3组青贮剂后，CP、EE 和 WSC 含量无显著差异（P＞0.05）。N1、N2和 N3组的 GE 均显著高于 CK 组（P＜0.05），且 N1、N2和 N3组之间无显著差异（P＞0.05）。N1、N2和N3组的 NDF 含量极显著低于 CK 组（P＜0.01），且 N2组极显著低于 N1和 N3组（P＜0.01），N1和 N3组之间无显著差异（P＞0.05）。N1、N2和 N3组的 ADF 含量均极显著低于 CK 组（P＜0.01），且 N1、N2和 N3组之间无显著差异（P＞0.05）。N1、N2和 N3组的 TDN 含量 极显著高于 CK 组（P＜0.01），且 N1、N2和 N3组 之间无 显著差异（P＞0.05）。

表2 青贮剂对再生稻头季全株青贮营养物质含量的影响（风干基础）Table 2 Effects of silage additives on nutrients of first season ratoon rice whole silage（air-dry basis）

2.2 青贮剂对再生稻头季全株青贮品质的影响

如表 3 所示，N1、N2和 N3组的乙酸含量显著高于 CK 组（P＜0.05），且 N1、N2和 N3组之间无显著差异（P＞0.05）。N1、N2和 N3组的 NH3-N/TN 显著低于 CK 组（P＜0.05），且N1、N2和 N3组之间无显著差异（P＞0.05）。

表3 青贮剂对再生稻头季全株青贮品质的影响Table 3 Effects of silage additives on quality of first season ratoon rice whole silage

2.3 青贮剂对再生稻头季全株体外发酵24 h 累积产气量和体外产气参数的影响

如表 4 所示，N2组的 24 h 累积产气量极显著高于 N1、N3和 CK 组（P＜0.01），且 N1、N3和 CK 组之间无显著差异（P＞0.05）。N2组的快速降解部分的产气量极显著高于 N1、N3和 CK 组（P＜0.01），且 N1、N3和 CK 组之间无显著差异（P＞0.05）。N2组的潜在产气量极显著高于 N1、N3和 CK 组（P＜0.01），且 N1组极显著高于 CK 组（P＜0.01）。

表4 青贮剂对再生稻头季全株青贮24 h 累积产气量和体外产气参数的影响Table 4 Effects of silage additives on 24 h cumulative GP and gas production parameters in vitro of first season ratoon rice whole silage

2.4 青贮剂对再生稻头季全株青贮体外瘤胃发酵特性的影响

如表 5 所示，体外瘤胃发酵 24 h 后，N1和 N2组的 pH 极显著低于 N3和 C K 组（P＜0.01）。N2组的乙酸和 NH3-N 含量显著高于 N1、N3和 CK 组（P＜0.05）。N1和 N2组的丙酸含量显著高于 N3和 CK 组（P＜0.05）。N2组的乙酸/丙酸显著低于N3和 CK 组（P＜0.05）。

表5 青贮剂对再生稻头季全株青贮体外瘤胃发酵特性的影响Table 5 Effects of silage additives on in vitro rumen fermentation characteristics of first season ratoon rice whole silage

2.5 青贮剂对再生稻头季全株体外发酵24 h 的营养物质降解率的影响

如表 6 所示，N2和 N3组的 DM 降解率和 CP 降解率显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）高于 N1和 CK 组。N2组的 OM 降解率、NDF 降解率和 ADF 降解率均极显著高于 N1、N3和 CK 组（P＜0.01），且 N1、N3和 CK 组之间无显著差异（P＞0.05）。

表6 青贮剂对再生稻头季全株青贮体外发酵24 h 的营养物质降解率的影响Table 6 Effects of silage additives on degradation rates of nutrients after 24 h in vitro fermentation of first season ratoon rice whole silage（%）

3 讨论

3.1 青贮剂对再生稻头季全株青贮品质的影响

乳酸菌制剂和酶制剂是目前青贮过程中最常见的发酵促进型添加剂。本试验采用的植物乳杆菌和粪肠球菌分别属于乳杆菌属和肠球菌属，都是目前用于生产乳酸的主要菌属，可以有目的地调节青贮原料内微生物区系，增加青贮初期乳酸菌的数量，迅速降低青贮原料的pH，抑制蛋白质分解，更有效地保存营养物质。但是乳酸菌在实际生产条件下的添加效果受植物本身附着的乳酸菌数量、碳水化合物的可利用性和环境因素的影响较大［24］，且有众多研究表明［6−7，25−26］，单独添加乳酸菌制剂无法有效降解NDF 和ADF，对提高青贮品质的效果有限，与酶制剂组合使用才能达到更佳的青贮效果。通过添加纤维素酶和半纤维素酶等，可以将植物细胞壁的纤维素分解为单糖和双糖，为乳酸菌繁殖提供所需营养。木聚糖酶属于半纤维素酶，与纤维素酶共同作用有降低青贮原料NDF 和ADF 的作用。本试验设计3 个菌酶组合，结果发现N1、N2和N3组与CK 相比，DM 含量有增加的趋势，说明3 组青贮剂均可以降低再生稻头季全株青贮DM 的损耗，提高青贮品质。N1、N2和N3组与CK 相比，CP 和WSC含量无显著差异，这与兴丽［27］研究添加乳酸菌对全株水稻青贮饲料营养成分的影响结果一致，但与徐然等［25］研究结果不同。主要原因可能是再生稻头季全株青贮原料的WSC 含量较低，且由于额外添加乳酸菌需要消耗更多的发酵底物，影响了乳酸菌的生长繁殖，建议在条件容许时，可以通过添加糖蜜等碳源来改善青贮品质。同时也有研究证明［28］，有些乳酸菌和酶制剂之间存在一定的拮抗作用，本试验的结果可能与此有关。N1、N2和N3组的总能显著高于CK，这可能是青贮过程中，青贮剂添加组青贮发酵时间短，热能散失较少。N1、N2和N3组与CK 相比，NDF 和ADF 含量显著降低，且N2组的NDF 含量显著低于N1和N3组，说明添加纤维素酶和半纤维素酶能在青贮过程中对植物细胞壁进行降解，使得NDF 和ADF 含量降低，改善了再生稻头季全株青贮的品质，改善效果以N2组青贮剂的菌酶组合更佳。TDN 含量是衡量饲料采食量和能量价值的重要指标［29−30］，本试验结果显示，N1、N2和N3组的TDN 含量显著高于CK 组，说明3 组青贮剂均可以提高饲料可利用率，改善青贮营养品质，效果以N2组青贮剂的菌酶组合更佳。

pH 决定了青贮饲料最终发酵品质的好坏及其营养损失的情况，其理想pH 在3.9～4.2［31］。本试验中各组pH均在4.5～4.6，虽然没能降到理想区间，但是纤维素酶在pH 为4.5 时活性最强［32］，能发挥其最佳作用。N1、N2和N3组的pH 与CK 组无显著差异，这与徐然等［25］的研究结果一致。pH 不在4.2 以下，可能是青贮原料的WSC 含量偏低，或是发酵过程中乙酸较乳酸的酸性弱，乳酸菌在发酵后期变得活跃，可以将乳酸转化为醋酸和1，2−丙二醇［33］，建议在条件容许时，可以适当添加WSC 含量较丰富的原料进行混合青贮来提高再生稻头季全株青贮品质。VFA 浓度是反映青贮品质好坏的重要指标。Kung 等［34］研究发现，高含量的乙酸可以显著提高青贮饲料的有氧稳定性。所以，乙酸含量可以作为判断青贮有氧稳定性的重要依据。本试验中，N1、N2和N3组乙酸含量与CK 组相比显著增加，对提高再生稻头季全株青贮品质具有促进作用。NH3-N/TN 被广泛用于衡量青贮品质的好坏。NH3-N 主要是由丁酸菌和大肠杆菌分解青贮原料中的有机含氮物质生成，从而使青贮饲料的营养价值降低［35］。本试验3 组添加青贮剂的NH3-N/TN 与CK 组相比显著降低，有效地抑制了植物酶和微生物对蛋白质的水解，这与钟书等［26］的研究结果一致。各组的NH3-N/TN 比例较高，主要原因可能是青贮饲料的pH 高于4.2，丁酸菌等有害微生物的活动未能得到有效地抑制［36］，同时青贮原料的TN 含量低（CP 为10.07%），少量NH3-N 产生也可造成NH3-N/TN 比例较高。总体来看，3 组青贮剂均可以在一定程度上改善青贮品质，但N2组青贮剂的菌酶组合效果更佳。

3.2 青贮剂对再生稻头季全株体外瘤胃发酵特性的影响

饲料的体外瘤胃发酵产气量可以反映饲料在瘤胃中的可发酵程度和瘤胃微生物的动态趋势，是评定反刍动物瘤胃发酵特性的重要指标。本试验结果显示，N2组的24 h 累计产气量和快速降解部分的产气量显著高于N1、N3和CK 组，同时，N1和N2组的潜在产气量显著高于CK 组，N2组的潜在产气量显著高于N1和N3组，说明再生稻头季全株青贮在添加了N2组青贮剂后，瘤胃微生物对底物的降解效率得到了提高，有利于瘤胃微生物的生长。

pH 是瘤胃内环境的重要指标，瘤胃微生物生长繁殖适宜的pH 范围为6.0～7.0［37］。体外发酵试验结果表明，各组 pH 均略高于 7.0，为 7.03～7.11，与雒瑞瑞等［38］的研究结果（pH 7.02～7.28）相似，对瘤胃纤维素分解菌的活性不会产生不良影响。N1和N2组的pH 显著低于N3和CK 组，说明添加N1和N2组青贮剂后，发酵液的环境较稳定，适合瘤胃微生物的生长。瘤胃中VFA 是微生物发酵日粮中碳水化合物产生的，其浓度的多少及组成成分不仅反映了碳水化合物在瘤胃中消化率的高低，同时也是衡量瘤胃微生物活力的重要指标，瘤胃发酵产生的VFA 以乙酸、丙酸和丁酸为主，占TVFA 的95%左右。乙酸是乳脂合成的主要前体物质，丙酸则是乳糖合成的主要前体物质。本试验中，N2组体外发酵产生的乙酸含量显著增加，N1和N2组的丙酸含量显著增加，说明添加N1和N2组青贮剂对再生稻头季全株青贮在瘤胃中的降解和能量转化有促进作用，且N2组更佳。乙酸/丙酸可以反映结构性碳水化合物和非结构性碳水化合物的供给情况。Lemosquet 等［39］提出，若是将乙酸/丙酸降低至一定范围内，可以综合提高动物的生产性能。本试验结果表明，N2组乙酸/丙酸显著低于N3和CK 组，原因可能在于N2组青贮剂的菌酶组合改变了瘤胃微生物的数量和区系，有利于瘤胃微生物的能量转化。瘤胃中NH3-N 既是微生物对底物含氮物质代谢的终产物，也是合成微生物蛋白（microbial protein，MCP）的主要氮源［40］，Owens 等［41］研究指出，瘤胃微生物合成MCP 所需的NH3-N 含量为0.35～29 mg·dL−1。本试验各组体外瘤胃发酵液NH3-N 含量（2.35～4.10 mg·dL−1）均位于正常范围，但略低，可能是在体外发酵试验中，发酵瓶内除了溶解在发酵液中的NH3-N，发酵滤渣中还有NH3-N 残留。在体外发酵试验中，N2组的NH3-N 含量与N1、N3和CK 组相比显著提高，说明添加N2组青贮剂对体外瘤胃发酵氮代谢具有促进作用。孟庆翔等［42］研究表明，体外发酵NH3-N 含量与体外产气量存在高度正相关，本试验结果与其相符。总体来看，N2组青贮剂的菌酶组合可以使瘤胃微生物作用增强。

青贮饲料所引起的瘤胃环境改变还表现在对营养物质的降解上。在体外瘤胃发酵试验中，N2和N3组的DM降解率和CP 降解率显著提高，同时，N2组的OM 降解率、NDF 降解率和ADF 降解率也显著提高，与陶莲等［5］的研究结果类似，说明添加N2组青贮剂后，瘤胃微生物对再生稻头季全株青贮的发酵利用效果更佳，原因可能是其发酵底物的TDN 含量升高。总体来看，添加N2组青贮剂可以在一定程度上提高再生稻头季全株青贮的瘤胃微生物利用效率。

4 结论

再生稻头季全株青贮原料在添加青贮剂比例为70%植物乳杆菌，20%粪肠球菌，5%纤维素酶和5%半纤维素酶发酵后，青贮品质更优，体外发酵后可显著提高累计产气量、快速降解部分的产气量和潜在产气量，增加乙酸和NH3-N 的含量，降低乙酸/丙酸，提高瘤胃OM 降解率、NDF 降解率和ADF 降解率。因此，在实际生产中，建议青贮剂在以植物乳杆菌为主要添加剂的前提下，辅助添加粪肠球菌、纤维素酶和半纤维素酶，有利于获得营养价值较佳的再生稻头季全株青贮。